המטסירמה רומיש לע ותעפשהו GOBLET

אפיון הגן GOBLET והשפעתו על שימור המריסטמה ויצירת עלה מורכב בעגבנייה lycopersicum) (Solanum חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה מאת יעל ברגר הוגש לסינט האוניברסיטה העברית בירושלים תשרי תשס"ח

3 עבודה זו נעשתה בהדרכתם של: דר' נעמי אורי הפקולטה למדעי החקלאות המזון ואיכות הסביבה, האוניברסיטה העברית, רחובות. דר' אלון סמך הפקולטה למדעי החקלאות המזון ואיכות הסביבה, רחובות. האוניברסיטה העברית,

4 ברצוני להודות : לנעמי על ההדרכה והליווי לחברי המעבדה בעבר ובהווה, על התמיכה, הפרגון ועבודת הצוות למשפחה שלי, על האהבה והעידוד

5 תקציר המריסטמה הקודקודית meristem-sam),(shoot apical של הנצר היא האזור בצמח ממנו מתפתחים כל האיברים העל קרקעיים במהלך חיי הצמח. התפתחות העלה מחולקת באופן (3) (2) מסורתי לשלושה (1) חלקים: איניציאציה מורפוגנזה ראשונית מורפוגנזה משנית והתרחבות. בשלב האיניציאציה מתפתח איבר חדש בשולי המריסטמה הקודקודית של הנצר. בשלב המורפוגנזה הראשונית מתרחשים תהליכים התפתחותיים המבססים את צורת העלה הבסיסית על ידי פעילות מורפוגנטית בשולי הפרימורדיה. משך הפעילות המורפוגנטית בשוליים תקבע את צורת העלה מבחינת מורכבותו, כיוון שזהו האזור ממנו נוצרים מבנים משניים כגון עלעלים ואונות. בשלב המורפוגנזה המשנית וההתרחבות מתרחש גידול בנפח ושטח העלה בכמה סדרי גודל לאחר שצורת העלה כבר קובעה ואין יכולת מורפוגנטית. בעגבנייה מתפתח עלה מורכב, אשר בו הטרף מפוצל לתת יחידות הנקראות עלעלים. בעגבנייה בודדו מוטנטים רבים המראים שינוי ברמת המורכבות של העלה והם מהווים כלי גנטי להבנת השלבים והתהליכים הקשורים ליצירת העלה וקביעת צורתו. גנים ממשפחת NAC Domain מתבטאים באזורי הגבול שבין המריסטמה הקודקודית של הנצר והאיברים אשר נוצרים בשוליה, ודרושים לתהליך הפרדת האיברים מן המריסטמה. הגן GOB שייך למשפחת NAC Domain ומתבטא באזור הגבול שבין המריסטמה הקודקודית של הנצר לאיברים המתפתחים בשוליה. מטרת המחקר הייתה להבין את תפקיד הגן (GOB) GOBLET בהתפתחות העלה המורכב בעגבנייה. המוטנט gob מראה איחוי של הפסיגים וחוסר ביצירה של מריסטמה פעילה, בדומה להשפעה של ירידה בגנים ממשפחה זו במינים נוספים. הסרת הפסיגים המאוחים בנבט מביאה להתאוששות והתפתחות צמח אשר מראה ירידה ביצירת עלעלים משניים,NAC Domain ואינטרקלארים. ידוע כי חלק מהגנים השייכים למשפחת מבוקרים על ידי (mir164),microrna164 המוריד את רמת התעתיק של גנים אלה באזורים בהם הוא מתבטא. mir164 במחקר זה נמצא, כי GOB נחתך על ידי וכי שינוי הרצף של אתר החיתוך מוריד את mir164 הבקרה על ביטוי.GOB ו- GOB מתבטאים בדפוס משלים, ותוצאה זו מרמזת כי Gob-4d מצמצם את רמת תעתיק GOB לאזור הגבול, וכך מבקר את פעילותו. באלל mir164,gob,mir164 קיימת פגיעה בבקרה על ידי המביאה לירידה בחיתוך אשר גורמת שינויים פנוטיפיים בכל שלבי התפתחות הצמח, הכוללים התפצלות של המריסטמה הקודקודית של הנצר

6 סביב בסיס העלעלים ועליה בביטוי שלו,,Gob-4d באלל GOB צמחים המראים עליה וירידה ברמת הביטוי של,GOB ליצירת עלעלים. מרמזות כי סימון ברור של גבול חשוב גנים המתבטאים במריסטמה יכולים להשפיע על צורת העלה ומורכבותו. שאלנו האם לשינוי GOB בביטוי GOB בעלה עצמו יש משמעות או שגורל העלה נקבע על פי שינויים בביטוי במריסטמה. במטרה לבודד את השפעת GOB על התפתחות העלה בנפרד מהשפעתו על פעילות המריסטמה נבחנו צמחים המבטאים את GOB ו- mir164 תחת פרומוטר ספציפי לעלים כאשר ירד ביטוי GOB בעלים נצפתה ירידה ביצירת עלעלים משניים ואינטרקלארים,.(pFIL),miR164,GOB בדומה למוטנט.gob עליה בביטוי שאינו נתון לבקרה על ידי הביאה לפגיעה נרחבת בגדילה והתרחבות הטרף וירידה במורכבות העלה. תוצאות אלו מעידות כי לפעילות GOB השפעה על שלבים שונים ביצירת העלה וכי פגיעה בהגדרת גבולות משפיעה גם על שלב התרחבות הטרף. האינטראקציות הגנטיות של GOB עם גנים המעורבים בקביעת צורת העלה נבחנו על ידי הכלאות ואפיון מוטנטים כפולים. הגן (IAA9) ENTIRE קשור למעבר סיגנאל האוקסין ומוטציה בגן (e) מביאה להתרחבות תחום הביטוי למספר שכבות תאים נוספות סביב בסיס העלעל. בצמחי Gob- 4d נראית העמקה של האונות בעלעלים, הגדלת העלעל הטרמינלי ופגיעה בהתארכות פטוטרות העלעלים. הדמיון הפנוטיפי מבחינת ירידה בניצוי המשני אך שמירת על רמת הניצוי הראשוני, בין גורמת ליצירת עלה עגבנייה פשוט. ירידה בביטוי GOB מחמיר את פנוטיפ העלה הפשוט במוטנט Gob-4d/Gob- ותוצאה זו מעידה כי הגנים פעילים בכיוון של עיכוב התמיינות. במוטנט הכפול e, מתפתחים עלים שבהם נראית עליה בהשפעת Gob-4d במהלך ההתפתחות. תוצאה זו,4d e/e מעידה כי במהלך ההתפתחות משתנים היחסים בין הגנים E ו- GOB, וכנראה הם פעילים בשני מסלולים משיקים. המוטנט (lyr) lyrate מראה עלים הדומים לעלים שהתקבלו כאשר הגן GOB בוטא ביתר בעלים ללא הבקרה על ידי.miR164 ירידה בביטוי GOB גרמה סופרסיה של פנוטיפ בחלק משלבי ההתפתחות ויצירת פנוטיפ חדש בעלים. תוצאה זו מעידה כי רק חלק lyr מהפנוטיפים הנראים במוטנט lyr נובעים מעלייה בביטוי.GOB

7 שימוש בעגבנייה, צמח בעל עלים מורכבים, איפשר לזהות את התפקיד של גני גבול ביצירת העלה GOB וקביעת צורתו, ולזהות את ההשפעה שיש להתרחבות ביטוי על תהליכים המשפיעים על מורכבות העלה.

8 תקציר... 5-7 תוכן... 8-11 מבוא... 12-33 1. המריסטמה והגבול... 12 2. התפתחות העלה... 13-16.2.1 איניציאציה- 13... Leaf initiation.2.2 מורפוגנזה ראשונית- 14...Primary morphogenesis.2.3 מורפוגנזה משנית והתרחבות- 15... Secondary morphogenesis and expansion 2.4.מורכבות העלה... 16 3. העלה בעגבנייה... 16-19 3.1. מוטנטים המראים עלייה במורכבות העלה... 17 3.2. מוטנטים המראים ירידה במורכבות העלה... 19 21-25...NAC domain genes.4 4.1. פעילות במריסטמה הקודקודית של הנצר והתפתחות העלה... 21.4.2 פלוריפוטנטיות 23... 4.3. בקרה על ביטוי 24...CUC 4.4. מבנה ופעילות החלבון... 24 5. מעורבות mir164 בבקרה של 25-26...CUC 6. אינטראקציה של CUC עם גנים ממשפחות אחרות... 26-30 26... TEOSINTE BRANCHED1, CYCLOIDEA and PCF (TCP).6.1 28...KNOTTED-like homeobox (KNOX I).6.2 29...ENHANCER OF SHOOT REGENERATION 2 (ESR2).6.3 29...JAGGED (JAG).6.4

א. ט. 9 30...ASYMMETRIC LEAVES 1, 2 (AS1, AS2).6.5 30...PIN FORMED1 (PIN)1, PINOID (PID).6.6 7 וקסין... 30-33 שיטות וחמרים... 34-53 1. שיטות עבודה עם חומצות גרעין... 34-39.1.1 הפקת 34... DNA.1.2 הפקת 34... RNA.1.3 הכנת 35...cDNA 35... PCR, RT-PCR.1.4 36... 1.5. ריצוף תוצרי PCR 1.6. שיבוטים ובניית פלסמידים...37 38...RLM-RACE 1.7 39...In Vitro Transcription.1.8 2. שיטות עבודה עם חיידקים... 39-40.2.1 טרנספורמציה לחיידקי 39...Escherichia coli.2.2 טרנספורמציה לחיידקי 40...Agrobacterium tumefaciens 2.3. הפקת פלסמיד מחיידקים... 40 3. צמחי עגבנייה... 40-41 3.1. גידול והכלאות... 40 3.2. הפקת זרעים... 41 3.3 מקור הצמחים... 41 4. צמחים טרנסגנים... 42 4.1. תרביות רקמה בצמחי עגבנייה... 42 4.2 רנספורמציה של צמחי ארבידופסיס... 42

10 5. קיבוע רקמה וחתכים... 43 43-...In Situ Hybridization.6 44 ß-Glucoronidase (GUS) צביעת.7 45... Scanning Electron Micrograph.8 45...(SEM) 9. מאגרי מידע...46 10. תמיסות... 46-53 מטרות המחקר... 54 תוצאות... 55-94 במהלך התפתחות הצמח, והגורמים המבקרים את ביטויו...- 55.1 ביטוי GOB 63 ביטוי GOB בגבולות מקדים התפתחות רקמה בציר.1.1 חדש... 55 מתבטא בשולי המריסטמה ובצינורות pgob.1.2 ההובלה... 57 GOB מבקר את ביטוי mir164.1.3 בעגבנייה... 60 2. תפקיד GOB בשימור המריסטמה, יצירת האיברים והתפתחות העלה המורכב בעגבנייה... 64-85

11 פגיעה GOB בפעילות גורמת לפגיעה בהתפתחות המריסטמה וירידה במורכבות.2.1 העלה... 64 2.2. העלייה בביטוי GOB במוטנט Gob-4d נובעת מפגיעה בבקרה על ידי,miR164 ומביאה לשינויים פנוטיפים נרחבים... 69 ביטוי אקטופי של GOB משפיע על התרחבות הטרף ועל צורת.2.3 העלה... 74 (sp-) צמח עגבנייה M82 מזן מסיים מפתח עלים ברמת מורכבות.2.3.1 עולה... 75 35S ביטוי אקטופי של GOB בעזרת פרומוטר גורם עיכוב בהתפתחות.2.3.2 הצמח... 75 ביטוי אקטופי של GOB בפרימורדיה גורם לשינוי בצורת העלה.2.3.3 והעלעלים... 78 בעזרת פרומוטר pgob מראים השפעה מועטה על צורת 2.3.4. צמחים המבטאים GOB העלה... 83 3. הקונטקסט הגנטי בו פועל 86-...GOB 94 במוטנט e מתפתחים עלים פשוטים המראים דמיון לעלים במוטנט.3.1 86... gob ירידה בביטוי GOB מחמירה את פנוטיפ העלה הפשוט של המוטנט.3.1.1 87...e ו- e Gob-4d משפיעים על צורת העלה דרך מסלולים.3.1.2 שונים... 89 במוטנט lyrate מתפתחים עלים המראים דמיון לצמח (lyr).3.2 90...pFIL>>GOB 4d

12 3.2.1. המוטנט lyr מחמיר את הפנוטיפ הנראה במוטנטים...Gob-4d 3.2.2. הירידה בביטוי GOB מחלישה חלק מהפנוטיפים של המוטנט 92...lyr 91 דיון...- 95 108 1. חשיבות קביעת גבולות ב- 95...patterning 2. תפקיד GOB בקביעת צורת העלה המורכב... 98 3. בקרה על ביטוי 102...GOB NAC 4. האבולוציה של משפחת 104...Domain יחסי הגומלין בין אוקסין, GOB וצורת.5 העלה... 104 6. אינטראקציות לא ליניאריות בהתפתחות העלה... 107 מקורות... 109-125 - נספח I רשימת הפרסומים... 126 Berger Y, Harpaz-Saad S, Brand A, Melnik H, Sirding N, Alvarez JP, - נספח II Zinder M, Samach A, Eshed Y, Ori N. (2009). The NAC-domain transcription factor GOBLET specifies leaflet boundaries in compound tomato leaves. 126-136... Development 136:823-832. מבוא

13 1. המריסטמה והגבול המריסטמה הקודקודית meristem-sam),(shoot apical של הנצר היא האזור בצמח ממנו מתפתחים כל האיברים העל קרקעיים במהלך חיי הצמח. המריסטמה הקודקודית של הנצר מחולקת לשני אזורים: מרכז המריסטמה Zone),(Central בעל צורה כיפתית ושולי המריסטמה Zone).(Casellano and Sablowski 2005) (Peripheral במרכז המריסטמה נשמר מאגר של תאים השומרים על אופי פלוריפוטנטי ומהווים מקור לאיברים שייווצרו בשולי המריסטמה (2003 al..(reinhardt et המריסטמה הקודקודית של הנצר מייצרת בשוליה פרימורדיות של איברים צדדיים כגון עלים, שבחייקם ניצנים. השלב ההתפתחותי שבו נמצא האיבר, שנוצר בשולי (P) המריסטמה, מוגדר לפי מיקומו היחסי בהשוואה למריסטמה, כאשר פלסטוכרון מוגדר כמרווח ההתפתחותי בין שני איברים עוקבים. בהתאם להגדרה זו, P1 הוא הפרימורדיום האחרון ו-( I1 ) Incipient שנוצר, P0 הוא האיבר הבא שעתיד להיווצר, מציין את המיקום הצפוי של יציאת העלה שלאחריו. פילוטקסיס מתאר את סידור האיברים סביב הגבעול המרכזי מבחינת Reinhardt 2005; ) מיקום ומרווח, והוא מבוקר באופן קפדני ומשפיע על מבנה הצמח.(Kuhlemeier 2007 על פי המודל המקובל היום, הנתמך בתצפיות במינים שונים, הפרימורדיום הקיים מספק מעין נקודת ייחוס, והפרימורדיום החדש יתפתח במרחק מינימאלי ממנו.(Reinhardt et al. 2005; Kuhlemeier 2007) במקביל לקביעת המיקום היחסי של האיבר במריסטמה, האיברים השכנים מגדירים את גבולות האיבר וכך משפיעים על גודלו הסופי. הגבול המפריד את פרימורדית האיבר מהמריסטמה נראה כמעין שקע שנוצר בעקבות עיכוב חלוקת תאים וגדילתם, והגדילה היא לאורך התא כך שמתקבלת מתיחה של התאים ) 2003; Hussey 1971; Kwiatkowska and Dumais.(Kwiatkowska ;2006 Kwiatkowska 2008 התאים המרכיבים את הגבול הם בעלי צורת אוכף וקעורים, בעוד שתאים במריסטמה ובפרימורדיה הם עגולים ושטוחים או קמורים ) and Aida נפח התאים בגבול נמוך מנפח התאים סביב הגבול, וההבדל בנפח עם גדל.(Tasaka 2006a,b התפתחות וגדילת הפרימורדיה (1971.(Hussey לאחר המעבר לפריחה המריסטמה הקודקודית של הנצר עוברת שינויים מבניים. פרחים נוצרים ממריסטמות פרח, שהן מודיפיקציות של מריסטמות חיקיות הנוצרות בשולי מריסטמת התפרחת. מריסטמות הפרח והתפרחת משמשות

14 al. 2004.(Breuil-Broyer et al. 2004; Laufs et פירוש אפשרי לתוצאות הוא שבתאי הגבול חלוקות התאים מעוכבות. 2. התפתחות העלה העלה הוא האיבר המשמש לקליטת האור בתהליך הפוטוסיניתיזה, תהליך שבו מיוצרת אנרגיה הדרושה להתפתחות הצמח. עלים הם מבנים סימטריים ושטוחים, אשר נוצרים בשולי המריסטמה. בעולם הצומח קיים מגוון רחב של צורות וגדלי עלים. העלים ממוקמים על גבעול רדיאלי ובחיקיהם מתפתחים ניצנים חיקיים. התפתחות העלה מחולקת באופן מסורתי לשלושה Poethig ) (3) (2) חלקים: (1) איניציאציה מורפוגנזה ראשונית מורפוגנזה משנית והתרחבות.(1997; Sinha 1999.2.1 איניציאציה- Initiation בשלב האיניציאציה מתפתח איבר חדש בשולי המריסטמה הקודקודית של הנצר. מקובל כי התפתחות הפרימורדיה וגדילתן מחוץ למריסטמה הכיפתית הוא תהליך הכולל שינוי בדפוס ביטוי Green 1980; ) גנים וכוחות מכאניים אשר מושפעים ומשפיעים על כיוון גדילת האיבר.(Kwiatkowska 2008 התפתחות וגדילה של איבר חדש, אשר יהיה נפרד מרחבית מהמריסטמה, דורש חלוקות תאים בציר שונה מאשר ציר החלוקה הקיים במריסטמה. L1 תאי (השכבה החיצונית של המריסטמה) מתחלקים בצורה אנטיקלינית, המשמרת את ציר הגדילה כפי שהיה L1, מתחלקים בצורה פריקלינית בתא המקור, בעוד שתאי L2 ו- L3, הנמצאים מתחת לשכבת ומאפשרים גדילה בכיוון חדש. ציר הגדילה החדש מתאפשר ע"י סידור שונה של המיקרופיברילות בדפנות התאים, והשינוי בציר הגדילה בשכבות הפנימיות יוצר לחץ מכני המביא לחלוקות גם

15 Green 1980; Reinhardt et al. 2003; al. 1997 Fleming et הציעו כי הבקרה על גמישות דופן התא משפיעה על.(Reddy et al. 2004 תהליך התארכות התאים וקובעת את קצב יצירת הפרימורדיה, הגודל והצורה הסופיים של הצמח ואיבריו. החוקרים בחנו את השפעת החלבון,Expansin אשר נמצא בדופן התא ומראה פעילות של עידוד התארכות דופן התא.in vitro כדי לבחון אם הוספה חיצונית של,Expansin המשפיע כנראה על גמישות פני המריסטמה, יכולה לדמות חלק מהתהליכים המכאניים האנדוגניים הקשורים לאיניציאציה של פרימורדיה מן המריסטמה ) 1997, al. Green 1980; Fleming et הוספה של Expansin ל- I2 במריסטמת.(Fleming et al. 1999; Reinhardt et al. 1998 העגבנייה, גרמה בחלק מהמקרים להתפתחות מבנים דמויי עלים, שהראו ביטוי של סמן להתמיינות העלה מוקדם מהצפוי. במבנים דמויי העלים לא התפתחה מערכת הובלה נורמאלית, ממצא המצביע כי ריכוך מכני של התאים אינו מספיק ליצירת עלה נורמאלי ) al. Fleming et נמצא כי בעגבנייה ישנם מספר גנים המקודדים ל- Expansin.(1997; Fleming et al. 1999 ומראים דגמי ביטוי שונים בזמן ובמרחב, לדוגמא LeExp18 מתבטא בשולי המריסטמה ומקדים את הגדילה הפיזית של הפרימורדיה, לעומתו LeExp9 מתבטא באזור שמתחת למריסטמה לאחר שחלוקות התא נפסקו 2003) al..(reinhardt et al. 1998; Vogler et.2.2 מורפוגנזה ראשונית- Primary morphogenesis המונח מורפוגנזה ראשונית מתאר תהליכים התפתחותיים המבססים את צורת העלה הבסיסית. באפונה נמצא, כי צורת העלה נקבעת בשלב שבו גודל הפרימורדיה הוא זניח ביחס לגודל הסופי של העלה, ובשלב זה הפרימורדיה מאבדת את יכולת הרגנרציה בתגובה לפגיעה מכאנית ) Sachs 1969). שלב המורפוגנזה הראשונית מתחיל בהתרחבות הטרף, והפרדת אזור הפטוטרת מהטרף (2001.(Sinha ;1999 Dengler and Tsukaya על פי המודל המקובל כיום, גדילת הטרף קורית באזור שבו נוצרת סמיכות בין רקמה אדקסיאלית (צד עליון של העלה) ואבקסיאלית (צד תחתון של העלה) והפעולה המנוגדת והסמוכה של גורמים אלה, היוצרת זהות שונה של שני צידי העלה, דרושה כדי שהטרף יתרחב 2001) al..(waites and Hudson 1995; Eshed et סוגי תאים

16.(Poethig ;1997 Raven 1999 צינורות ההובלה מאורגנים מרחבית כהמשך ישיר של סידורם בגבעול, כך שהשיפה היא אבקסיאלית והעצה אדקסיאלית. רצועת התאים בשולי הפרימורדיה marginal היא בעלת פוטנציאל מורפוגנטי ונקראת.marginal blastozone ה- פעילות.(Hagemann and Gleissberg 1996) מבססת את ציר הגדילה כלפי שולי העלה blastozone המיקום ומשך פעולת איזור זה יקבעו את צורת העלה מבחינת מורכבותו, כיוון שזהו האזור ממנו נוצרים מבנים משניים כגון עלעלים. בעלה נקבע גם ציר פרוקסימו-דיסטאלי, מהקצה התחתון של הפטוטרת ועד קצהו העליון של הטרף, שלאורכו נמצאה שונות רבה בקצב ואוריינטציית חלוקות התאים. במקביל להתרחבות הטרף מתרחשות חלוקות בציר הפטוטרת והעורק המרכזי המביאות להתעבות הפטוטרת, ומרחיקות את הטרף מהגבעול ) Tsukaya Poethig ;1997 Dengler and 2001). התמיינות באזיפטאלית מוגדרת כהתמיינות מהקצה המרוחק של האיבר לכיוון הבסיס, לעומת התמיינות אקרופטאלית, שהיא התמיינות מהבסיס לכיוון הקצה. בעגבנייה התמיינות העלה היא באזיפטאלית, כלומר העלעלים מתפתחים בעלה לכיוון הפטוטרת (1999.(Sinha.2.3 מורפוגנזה משנית והתרחבות- Secondary morphogenesis and expansion שלב זה הוא ארוך ומייצג גידול בנפח ושטח העלה בכמה סדרי גודל לאחר שצורת העלה כבר קובעה ואין יכולת מורפוגנטית (1997.(Sachs ;1969 Poethig צורת ההתרחבות יכולה לשנות או לשמר את צורתו הראשונית של העלה. חלוקות תאים אנטיקליניות בטרף מביאה ליצירת סוגי תאים ורקמות שונים בעלה. תקשורת ותיאום בין שכבות התאים השונות הן הכרחיות על מנת לקבל עלה נורמאלי ללא התקפלות או הבקעות של פני העלה ) and Sinha ;1999 Dengler.(Tsukaya 2001 2.4. מורכבות העלה

17 עלים מראים מגוון עצום של צורות וגדלים בטבע. אחת החלוקות הבסיסיות בין הצורות השונות מתייחסת לרמת המורכבות של העלה: בעלה פשוט הטרף הוא יחידה אחת, ולעומתו בעלה מורכב הטרף מפוצל לתת יחידות הנקראות עלעלים, שלהם פטוטרת נפרדת ומאורגנים לאורך העורק המרכזי (1999 al..(goliber et העלה מוגדר כאיבר מסיים, כלומר שממנו לא יתפתחו איברים נוספים. קיימות שתי היפותזות באשר למקורו של מבנה העלה המורכב. גישה אחת משווה עלעל בעלה מורכב לעלה פשוט, במודל זה העלה הוא יחידה בלתי מסיימת בעלת מאפיינים של נצר ועלה יחדיו, כלומר ישנה יכולת לייצר עוד איברים על העלה. גישה השניה רואה בעלה המורכב כולו כשווה ערך לעלה פשוט, שבו העלעלים נוצרים מחלוקה של הטרף הפשוט. היפותזה זו תופסת את צורת העלה כרצף המשתרע מעלה פשוט בעל שוליים חלקים ועד לעלה בעל אונות (אזורים שקועים בהיקף ללא פטוטרת נפרדת) או עלה מורכב (2004.(Champagne and Sinha עלעלים דומים לעלה פשוט במאפיינים המורפולוגיים אך הם חסרי ניצן חיקי, והם מסודרים לאורך העורק המרכזי של העלה או שהם מתפתחים בצורה מקובצת מקצה העורק המרכזי. עלעלים משניים מתפתחים לאורך הפטוטרת של העלעלים הראשוניים ומהווים רמה נוספת של ניצוי. רמת המורכבות של העלה ניתנת לתיאור בהתאם למספר מאפיינים: מספר העלעלים בעלה, מספר Holtan and Hake 2003; ) רמות הניצוי וצורת שולי העלה- האם הם חלקים או בעלי אונות.(Brand et al. 2007 3. העלה בעגבנייה העלה נוצר כפרימורדיום גלילי המתפתח בשולי מריסטמת הנצר, ותאים בשולי הפרימורדיום מהווים את המקור ל- blastozone marginal שיאפשר התרחבות והתמיינות של הטרף והחלוקה לעלעלים (1996.(Hagemann and Gleissberg העלה בעגבנייה מורכב מעורק מרכזי, שבקצהו עלעל טרמינלי ומספר זוגות עלעלים צדדיים מפוזרים לאורכו, העלעלים הם מאונים ולרוב האונות מתפתחות ברצף אקרופטאלי. המתפתחים באזיפטאלית. עלעלים אינטרקאלאריים מתפתחים מאוחר יותר בין העלעלים הראשוניים. בעלה נראה גם ניצוי משני, שבו על עורק העלעל הראשוני מתפתחים עלעלים משניים. בעגבנייה בודדו מוטנטים רבים המראים שינוי ברמת המורכבות של העלה ) 2007; al. Dengler 1984; Menda et al. 2004; Brand et.(tgrc.ucdavis.edu להלן תיאור של חלק מהמוטנטים אשר קשורים לעבודתי.

18 3.1. מוטנטים המראים עלייה במורכבות העלה גנים ממשפחת (KNOXI),KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX מקודדים לפקטורי שעתוק,Homeodomain ובעלי תפקיד מרכזי בשימור המריסטמה הקודקודית של קושרי DNA מסוג הנצר. ירידה בביטוי גנים ממשפחת KNOXI באתר של התפתחות העלה העתידי (P0), מקדימה את הופעת העלה. בחלק מהמינים בעלי עלה מורכב ביטוי KNOXI עולה שוב בהמשך ההתפתחות בפרימורדיה העלה 2006).(Hareven et al. 1996; Chen et al. 1997; Hay and Tsiantis ביטוי ביתר של KNOXI בעגבנייה גרם להתפתחות עלים מורכבים מאוד בעלי ניצוי ברמה שישית Tkn1 :KNOXI בעגבנייה נחקרו שני בני משפחת.(Hake et al. 1989; Hareven et al. 1996) Chen et al. 1997; Janssen et al. 1998; Reinhardt et al. ) ו- LeT6/Tkn2 (TomatoKn1) מתבטא במריסטמה הקודקודית ובפרימורדית העלה באזור שיתרחב לטרף, ו- Tkn1.(2003 מתבטא במריסטמה הקודקודית של הנצר, בפרימורדית העלעל ובשוליו, LeT6/Tkn2 ובפרימורדית העלה יש ירידה בביטוי שלו 1997) al..(hareven et al. 1996; Chen et מבטאים את LeT6/Tkn2 ביתר. בעוד המוטנטים הדומיננטיים ear(me) Mouse ו-( Cu ) Curl שבשני מוטנטים אלה מתפתחים עלים מורכבים יותר בהשוואה ל- WT, נראית בהם השפעה שונה Cu על הארכיטקטורה של הצמח 1997) al..(chen et al. 1997; Parnis et במוטנט העלווה קומפקטית והעלים מסולסלים, לעומת זאת בעלים של המוטנט Me הפטוטרת מתארכת והטרף בעלעלים מראה יחס אורך:רוחב שונה בהשוואה לצמח נורמאלי (1997 al..(parnis et במוטנט Me הגן LeT6/Tkn2 מתבטא בצורה נרחבת יותר במריסטמה, ויש התפשטות של הביטוי לקצה העלה המתפתח. צמחים המבטאים 35S:LeT6/Tkn2 מראים עלים בעלי רמות שונות של מורכבות: מעלה חוטי שאינו מתרחב ועד עלה מורכב מאוד, בעל מספר רמות ניצוי. בעלים שבהם יש התרחבות של הטרף מתקבל שינוי גם בצורת העלעל (1998 al..(janssen et טריכומות הן שערות המופיעות על גבי עלים ועלי גביע ומשמשות סמן להתקדמות ההתמיינות של הרקמה ההתמיינות בעלה עגבנייה נורמאלי קורית באופן.(Hagemann and Gleissberg 1996) באזיפטאלי (לכיוון הבסיס), כך שטריכומות מופיעות קודם בקצה העלה. לעומת זאת, לעיתים

19 Chen et al. ) דפוס התמיינות העלה הוא אקרופטאלי (לכיוון הקצה) 35S:LeT6/Tkn2.(1997; Janssen et al. 1998 המוטנטים (clau) clausa ו-( tp ) tripinnate מראים עלייה במורכבות העלה. בשני המוטנטים Avivi et al. ) Tkn1 הבודדים ובמוטנט הכפול tp clau נראית עלייה ברמת הביטוי של ו- Tkn2 tp clau הפסיגים של המוטנט הכפול מראים פיצול ועל הצמח.(2000; Jasinski et al. 2007 clau מתפתחות רקמות אקטופיות. החוקרים הציעו כי הגנים ו- tp מבקרים את תזמון יצירת העלעלים, ומשתתפים בבקרה שלילית של Tkn1 ו- Tkn2 וכך מגדירים את היכולת של העלה ליצר עלעלים, ומשפיעים על תזמון יצירת העלעלים( 2007 al..(jasinski et המוטנט (Pts) Petroslinum מראה ניצוי ברמה שלישית בהשוואה לצמח נורמאלי המראה שתי דרגות ניצוי (2008 al..(kimura et הגן Pts בודד ונמצא כי הוא שייך לקבוצה ייחודית במשפחת שבה חסר מרכיב ה- homeodomain, האחראי על הקישור לDNA. המוטציה אשר KNOXI הביאה לעלייה במורכבות העלה ממוקמת ברצף הפרומוטר של הגן, ובמוטנט נמצאה עלייה ברמת הביטוי של הגן 2008) al..(kimura et המוטנט (bip) bipinnata מראה עליה במורכבות העלה BIP הגן.Pts ברמה דומה למוטנט Pts וגם בו קיימת עלייה בביטוי שובט ונמצא כי הוא שייך למשפחת חלבוני,BELL-like homeodomain אשר עוברים אינטראקציה פיזית עם חלבונים,in vitro ממשפחת KNOXI בארבידופסיס. בבחינה של אינטראקציה של שני חלבונים אלו KNOXI BIP נמצא כי Pts מעכב את האינטראקציה של עם חלבוני אחרים ) al. Kimura et 2008). נראה כי חלבוני KNOXI הם בעלי חשיבות רבה בקביעת צורת העלה בעגבנייה, ושינוי ברמת או מיקום הפעילות בעקבות שינויים בגנים אשר עוברים אינטראקציה עם חלבוני,KNOXI משפיע על צורת העלה הסופית. 3.2. מוטנטים המראים ירידה במורכבות העלה המוטנט הקלאסי הדומיננטי (La) Lanceolate הוא בעל עלים קטנים ופשוטים בעלי טרף מאורך ) 2007 al..(caruso 1968; Mathan and Jenkins 1962; Stettler 1964; Ori et לאחרונה בודד

20 LA ונמצא כי הוא משפיע על חלון הזמן בו פעילים שולי העלה מבחינה מורפוגנטית, ובמוטנט Ori et ) החלון המורפוגנטי מצטמצם ולכן נשאר מרחב התפתחותי צר יותר ליצירת עלעלים La.(al. 2007 במוטנט הרצסיבי (e) entire מתפתח עלה פשוט בעל טרף רחב וגדול. המוטנט e פגוע בגן,IAA9 המראה דמיון ברצף למעכב סיגנאל האוקסין בארבידופסיס, והורדה של ביטוי IAA9 בעגבנייה e.(wang et al. 2005; Zhang et al. 2007) חיקתה את עלה e המוטנט מראה פנוטיפים הדומים למצב של רגישות מוגברת לאוקסין כגון פרתנוקרפיה וירידה ברמת השלטון הקודקודי. בנוסף, הוספת מעכב הובלת אוקסין (NPA) לצמח,WT גרמה להתפתחות עלה פשוט ) et Wang.(al. 2005 בבחינה של תהליכי התפתחות העלה במוטנטים e ו- La נמצא, כי גודל המריסטמה הקודקודית, סידור העלים הצעירים בקודקוד ודפוס התרחבות רקמת העלה נשמרים בין המוטנטים וצמח.(Dengler 1984) נורמאלי, למרות השוני הגדול בפנוטיפ הסופי של העלה השוני בין הצורה הסופית של העלה נובעת משינוי בקצב ומשך התפתחות העלה ושינוי ביחס בין גודל העלעלים לגודלו הכולל של העלה. בצמח הנורמאלי התפתחות העלעלים הצדדיים מתחילה מוקדם יותר ונמשכת יותר זמן, ולכן נוצרים יותר זוגות של עלעלים צדדיים. במוטנט e גדילת הטרף של העלעל הטרמינאלי מתחילה ומסתיימת מוקדם יותר בהשוואה לצמח נורמאלי, ובמוטנט La הטרף היא איטית יותר ולכן העלה הסופי הוא מאורך (1984.(Dengler התארכות המוטנט gob מראה פגיעה בהתפתחות המריסטמה הקודקודית של הנצר (ארנון ברנד עבודת gob חיתוך הפסיגים בנבט.(Brand et al.2007 מסטר 2006, מביא להתפתחות עלים המראים GOB ירידה ברמת המורכבות, תוצאה המרמזת על הגן מעורבות בתהליך התפתחות הצורה NAC domain בעלה העגבנייה. GOB הגן שובט ונמצא כי הוא שייך למשפחת (ארנון ברנד עבודת מסטר al.2009,2006.(berger et NAC domain genes.4 משפחת NAC domain היא משפחה גדולה של חלבונים, הייחודים לצמחים ופעילים בתפקידים מגוונים בהתפתחות, הגנה, ותגובות לעקה אביוטית (2005a.(Olsen et al. רצף NAC Domain

21 CUP SHAPED COTELYDON מפטוניה, ATAF ו-( CUC ) MERISTEM (NAM) מארבידופסיס. NAC Domain משפחת מתחלקת פילוגנטית לשתי קבוצות עיקריות בהתאם לרמת השימור של,NAC Domain ורוב הגנים אשר אופיינו שייכים לתת קבוצה שבה נמצאים חלבונים דמויי.CUC 4.1. פעילות במריסטמה הקודקודית של הנצר והתפתחות העלה CUP SHAPED בארבידופסיס בודדו מספר גנים השייכים למשפחת NAC domain וביניהם המראים דמיון גבוה לגנים מלוע הארי ומפטוניה, COTELYDON 1,2 (CUC1, CUC2) nam ומשתייכים לאותו ענף בעץ הפילוגנטי (2003 al..(weir et המוטנטים מפטוניה, (cup) cupulifomis מלוע הארי ושילובים כפולים של cuc1, cuc2, cuc3 מארבידופסיס מראים איחוי של הפסיגים והפסקה של התפתחות המריסטמה ) 1997; al. Sour et al. 1996; Aida et al. 2003.(Weir et al. 2003; Vroemen et בפטוניה ולוע הארי בשלב מסוים מתפתח נצר ממריסטמה אקטופית shoot),(escape המתפתח לצמח שלם, ובמקרים אלה גם שנוצר הפרח,NAM In Situ Hybridization מראה איחוי איברים. באנליזת ביטוי בשיטת נמצא כי הגנים CUP מתבטאים בעובר סביב מריסטמת הנצר המתפתחת. בשלב מאוחר יותר,CUC2,CUC1 הביטוי נעשה חזק ומתרכז בשני פסים סביב המריסטמה הקודקודית. בשלב הרפרודוקטיבי מתבטאים הגנים בין המריסטמה הקודקודית לעלה החפה, ובין מריסטמת התפרחת למריסטמת הפרח, ומגדירים בפרח את האזורים בין הדורים השונים ) 1999; al. Sour et al. 1996; Aida et al. 2003.(Takada et al. 2001; Weir et בעובר נורמאלי מתפתחות שתי תפיחות בחלק העליון המסמנות את הפסיגים אשר עתידים לגדול. במעקב אחר השלבים הראשונים של ההתפתחות העוברית במוטנט הכפול cuc1 cuc2 בארבידופסיס לא נצפו הבדלים בין המוטנט הכפול לצמח הנורמאלי. בהמשך ההתפתחות במוטנט הכפול, בשלב הלב, העובר הוא שטוח וצר בחלקו העליון בהשוואה לעובר נורמאלי, ונראה בו איזור שקוע, ומאוחר יותר יש יצירה של טבעת סביב המריסטמה אשר מתפתחת למבנה הגביע המתקבל מאיחוי הפסיגים. 35S::CUC1 גרם ביטוי

22 Takada et al. 2001). לסיכום, דגם הביטוי של הגנים ופנוטיפ המוטנטים מרמז כי גנים אלה פעילים בקביעת הגבול שבין המריסטמה לאיברים, על ידי שימור המצב מריסטמטי של התאים בהם CUC1 CUC2 מתבטאים. ו- בארבידופסיס נמצא כי חלק מהגנים אשר שייכים למשפחת NAC domain מבוקרים ע"י Mallory et al. 2004b; Laufs et al. 2004; Guo et al. 2005; Nikovics et al. ) mir164 al. 2007 ;2006). Sieber et החוקרים ביקשו לבדוק איך יראה צמח כאשר יבטאו בו גנים עמידים לחיתוך ע"י mir164 ולכן ביטאו את הגנים לאחר שהוכנסו בהם מוטציות באתר ההכרות. הגן אשר הוכנסה בו המוטציה מסומן.GENEm ביטוי הגן בצורתו העמידה לבקרה ע"י,miR164 מאפשר ביטוי של הגן גם באזורים בהם קיים CUC1m ולהרחיב את מתחם הגבול אותו מגדירים CUC1 ו- CUC2. ביטוי בעזרת,miR164 הפרומוטר של הגן,CUC1 הביא לשינוי באוריינטציה של הפסיגים בנבט, ירידה באורך הפטוטרת של עלי השושנת ועליה ברוחב העלים. בפרח ישנו שינוי במספר ומיקום עלי הגביע ועיכוב של יצירתם והתבגרותם. ריבוי עלי כותרת מביא לפתיחה מוקדמת של פרחים שאינם בוגרים (2004b.(Mallory et al. בצמחים המבטאים CUC2m יש עלים בעלי היקף משונן. בפרח התרחב תחום הביטוי של הגן CUC2 והביא להגדלת המרווח שבין עלי הגביע, ולפעמים גם לעלי השחלה שאינם מאוחים לחלוטין 2006) al..(nikovics et בצמחים אלה נצפתה ירידה במספר ואורך התאים בפרקים וכן לירידה בהתארכות הגבעול ושינוי בפילוטקסיס של הפרחים סביב הגבעול על CUC1 ו- CUC2 תוצאות אלו מצביעות כי הבקרה של mir164.(peaucelle et al. (2007 חשובה לשימור אזורי גבול בין האיברים ומשפיעה על רמת איחוי האיברים. CUC3 מתבטא בעובר במרווח שבין הפסיגים, ולאחר התפתחות המריסטמה הביטוי הוא בגבול שבין המריסטמה לפסיגים, ובין המריסטמה לפרימורדית העלה (2003 al. CUC3.(Vroemen et אינו מכיל את רצף ההכרה של,miR164 ורמת הביטוי שלו אינה משתנה כאשר מבטאים ביתר את.(Mallory et al. 2004b; Laufs et al. 2004) mir164

23 בבחינה של היחס הפילוגנטי בין רצפי חלבונים שונים ממשפחת,NAC domain נמצא כי CUC3 נמצא בענף נפרד בתוך תת הקבוצה המכילה גם את CUC2,CUC1 ו- NAM Vroemen et al. ) 2003). שילובי מוטנטים שונים בין שלושת הגנים CUC2,CUC1 ו- CUC3 הראה כי לירידה ב- CUC2 השפעה רבה יותר על יצירת מריסטמה פעילה, כיוון שרק שילובים שהכילו את cuc2 היו חסרים מריסטמה פעילה 2003) al..(vroemen et המוטנט gob מראה איחוי פסיגים וחוסר התפתחות של המריסטמה (2007 al..(brand et הגן mir164 בעל הומולוגיה גבוהה לגן CUC2 בארבידופסיס, ומכיל את רצף ההכרה של ו- GOB.(Berger et al. 2009 (תמונה 1, NAC domain 4.2. פלוריפוטנטיות מאפיין ייחודי לצמחים הוא היכולת לשמור על פלוריפוטנטיות, כלומר היכולת של רקמה ממוינת לחזור למצב לא ממוין, ולעבור חלוקות תאים המביאות ליצירת רקמות שונות. CUC1 ו- CUC2 מופעלים במעבר מתאים בעלה לפרוטופלסטים או היווצרות קאלוס ונצרים בתרבית באזורים שבהם מתפתחת מאוחר יותר מריסטמה ) al. Cary et al. 2002; Daimon et al. 2003; Avivi et al. 2007 ;2004). Gordon et יצירת נצרים בקאלוס נבחנה בתרבית של צמחי L.er ומוטנטים.cuc1 cuc2,cuc2,cuc1 נמצא, כי במוטנטים נוצרו פחות נצרים ורוב הרגנרציה הביאה ליצירת.(Daimon et al. 2003) ליצירת ולא עלים, מריסטמות מאורגנות תוצאות אלו מרמזות כי CUC1 ו- CUC2 מעורבים בשימור מצב פלוריפוטנטי ברקמה וחשובים לתהליך יצירת מריסטמה CUC2 CUC1 מאורגנת. ביטוי ביתר של או הביא לעלייה ביצירת נצרים בתרבית שמקורה מהמוטנט הכפול.cuc1 cuc2 תוצאה זו מעידה כי הגנים CUC1 ו- CUC2 משפיעים באופן בלתי תלוי על יצירת נצרים בתרבית. al. 2007 Gordon et השתמש בשורשים המבטאים pcuc2:gfp במערכת של תרבית רקמה כדי לזהות האם יש קשר בין ביטוי pcuc2:gfp למיקום הנצרים המתפתחים מן הקאלוס. העברת הקאלוס למצע עשיר בציטוקינין גרם להתרכזות ביטוי pcuc2:gfp לאזור של צברים שבהם מספר תאים מצומצם, מהם התפתחו

24 נצפה בתאים קטנים שמתחלקים בקצב מהיר. תאים אלה pcuc2:gfp התפתחו בהמשך לתאי האם של הנצר, ובנצר שהתפתח הביטוי היה סביב המריסטמה. תוצאות אלה מעידות כי התארגנות של מריסטמות ויצירת נצרים מאורגנים דורשת פעילות מתואמת של הורמונים ו-.CUC2 4.3. בקרה על ביטוי CUC al. 2006 Kwon et ערכו סריקה של צמחי cuc2 שעברו מוטגנזה, במטרה לזהות גנים המבקרים חיובית את.CUC2 בסריקה נמצאו הגנים AtBRM ו-( SPLAYED(SYD, אשר שייכים למשפחת.SWI/SNF chromatin remodeling ATPases חלבונים אלה משפיעים על האינטראקציה בין היסטונים והדנ"א, וכך משנים את הנגישות של אזורי קשירה של בקרי שעתוק שונים. מוטנטים בודדים atbrm,syd מראים איחוי של איברים בפרח. המוטציה ב- AtBRM החמירה את פנוטיפ.cuc1 המוטנטים הבודדים cuc1,cuc2,cuc3 בעוד שמוטציה ב- SYD החמירה רק את פנוטיפ CUC1,CUC2,CUC3 החוקרים הסיקו ש- AtBRM מבקר את ביטוי ו- SYD מבקר רק ביטוי.CUC1 4.4. מבנה ופעילות החלבון חלבונים ממשפחת NAC domain הם בעלי יכולת להצטבר בגרעין התא, ליצור הומו- והטרודימרים ולשפעל ביטוי של גנים מדווחים בשמרים ובצמחים ) et Taoka et al. ;2004 Olsen.(al. 2005b הקצה ה- C -טרמינלי פעיל בהפעלה של שעתוק ומורכב מחומצות אמינו השכיחות באתרים הידועים כמאקטבי-שעתוק בצמחים. בבחינה של האזורים המשפיעים על רמת הפעילות NAC של חלבוני,CUC כי למוטיב נמצא, יש השפעה גדולה על התפתחות נצרים אקטופיים בתרבית, אך לאזור ה- C -טרמינלי יש פחות חשיבות לתהליך זה, ומוטיב ה- NAC הוא שקובע את הספציפיות של החלבונים שנבדקו CUC2).(Taoka et al. 2004) (CUC1, קביעת זה לתהליך

25 ANAC019 מארבידופסיס, אשר רמת הביטוי שלו עולה בתגובה לטיפול בחומצה אבציסית (2004 al..(ernst et לאחר קביעת המבנה ניתן לשער את השפעת המוטציות בגנים ממשפחת NAC domain על פעילות החלבונים ועל פנוטיפ הצמח 2005a) Olsen et al. 2005a.(Olsen et al. הציעו כי המוטציה בגן NAM בפטוניה פוגעת ביכולת ליצור דימר או בהפרעה לקשר בין שני אזורים בחלבון, ובמוטנט,cuc1-4 שבו יש החלפה של חומצת אמינו, נוצר מתח מבני וחוסר יציבות עקב החדרת שייר רחב לכיס הידרופובי קטן.(Olsen et al. 2005a) NAC domain המידע אשר קיים בספרות מדגים את חשיבותם של חלבוני במסלולים שונים בצמח, אך נדרש מחקר נוסף בכדי לקשר את מבנה החלבונים לפעילות הביולוגית שלהם. 5. מעורבות mir164 בבקרה של CUC stem-,(~21bp) הם מולקולות RNA קצרות המתקבלות מעיבוד מבנה microrna (mir) mir של פרקורסורים ארוכים יותר, המקודדים בגנום אך אינם מתורגמים לחלבון. loop מבקרים רמה של ביטוי גנים ע"י חיתוך של RNA בעלי דמיון גבוה או ע"י עיכוב התרגום. בצמחים נמצאו משפחות רבות של,miR המבקרים תהליכים התפתחותיים רבים כגון: קביעת פולאריות באיברים, פעילות המריסטמה, צורת הפרח, התפתחות מערכת ההובלה, גדילת שורשים צדדיים ותגובה להורמונים 2007) al..(chen 2005; Yang et בגנום הארבידופסיס ישנם שלושה גנים המקודדים ל- mir164 - Sieber et al..mir164a,b,c MIR164A,B,C בחן את התפקידים הספציפיים והחופפים של הגנים במהלך התפתחות 2007 הצמח ותפקידם בשמירה על אחידות (robustness) התפתחותית. בבחינת דפוס הביטוי של הגנים המוכתב על ידי הפרומוטר נמצא כי ישנה חפיפה חלקית באזורי הביטוי של mir164a ו- Nikovics et ) עם זאת, פגיעה בגנים אלה משפיעה על מאפיינים שונים בפנוטיפ הצמח.miR164C המוטנט mir164a מראה עלייה בעומק האונות סביב היקף.(al. 2006; Sieber et al. 2007 העלה, ובחינה של התפתחות האונות העלתה שמספר ומיקום האונות לא השתנה אלא יש ביטוי

26.(Nikovics et al. 2006) בסינוס, המביא להעמקת האונות המוטנט CUC2 mir164b אינו מראה שינוי פנוטיפי כלשהוא בשלב הווגטטיבי (2004b.(Mallory et al. המוטנט פגוע בגן,miR164C ומראה עלייה במספר עלי הכותרת, בעיקר early extra petals 1 (eep1) בפרחים הראשונים (2005 al..(baker et במוטנט eep1 יש עלייה ברמת הביטוי של CUC1 ו- CUC2 אך אין התרחבות של אזור הביטוי. נראה אם כן, כי mir164c אינו מפרק את התעתיקים מתאים שאינם תאי גבול אלא מבקר את רמת התעתיק בתאים בפיזור שקבוע מוקדם יותר (2007 al..(sieber et במוטנט המשולש mir164abc התקבלה ירידה ניכרת ברמת הביטוי של,miR164 המתבטאת בעלייה בשינון בהיקף העלים, שונות רבה במספר וגודל איברי הפרח, וחוסר איחוי של עלי השחלה (2007 al..(sieber et במוטנט mir164abc סידור הפרחים סביב הגבעול והתארכות הגבעול בין הפרחים משתנים, ונוצרים צברים של פרחים לאורך הגבעול. בחינה של צורת התאים באזור המפרק הראתה שבמוטנט mir164abc יש עיכוב בחלוקת תאים ולכן אין התארכות בין פרחים עוקבים (2007 al..(sieber et לסיכום הגנים המקודדים ל- mir164 מתבטאים בדפוסים ייחודיים שאינם חופפים במלואם לפיזור המרחבי של תעתיקי גני המטרה, ולכן מתקבלת השפעה שונה של הירידה בביטוי mir164 על ביטוי גני המטרה ברקמות השונות. ביטוי של 35S:MIR164A/B הביא לרמות שונות של איחוי איברים השושנת עלי (פסיגים, והגבעול) במהלך ההתפתחות, ובפרח התקבל איחוי של עלי הגביע והאבקנים שהביא לנשירה מאוחרת של עלי הגביע מהתרמיל 2004) al..(mallory et al. 2004b; Laufs et תוצאות אלו מעידות כי לבקרה על ידי mir164 השפעה ניכרת על כוונון אזורי הביטוי של גנים ממשפחת,CUC והגדרת המתחמים המפרידים בין איברים. 6. אינטראקציה של CUC עם גנים ממשפחות אחרות

27 TEOSINTE BRANCHED1, CYCLOIDEA and PCF (TCP).6.1 פקטורי השעתוק השייכים למשפחת,TCP נמצאו פעילים בקביעת צורת העלה וצורת הצימוח במינים רבים 2007) al..(nath et al. 2003; Palatnik et al. 2003; Ori et בלוע הארי בודדו המוטנטים cycloidea(cyc) cincinnata(cin), בעקבות שינוי בפנוטיפ עלי הכותרת, והגנים cin.(luo et al. 1996) נמצאו שייכים למשפחת TCP העלה של מוטנט הוא עגול ומסולסל בהשוואה ל- WT, ונראה כי השינוי בצורתו של העלה נובע מהארכת השלב שבו העלה גדל. במוטנט cin חזית עצירת החלוקה מתקדם בצורה מעגלית ולא ישרה, כך שיש גדילה מוגברת בשולי העלה. al.2003 Nath et הציעו כי CIN משפיע על יצירת עלה שטוח ע"י העלאת הרגישות של התאים בשוליים לסיגנאל עצירת חלוקה, המתקדם מקצה העלה אל בסיסו. המוטנט הדומיננטי הקלאסי (La) Lanceolate בעגבנייה מראה עלים פשוטים ומאורכים ביחס LA.(Dengler 1984; Ori et al. 2007) לעלה של צמח WT הגן בודד ונמצא שייך למשפחת והמוטציה ממוקמת באזור הקשירה של.MIR319 בבחינה של תוצרי חיתוך הגן ע"י,TCP Ori ) נמצא כי גם האלל המוטנט נחתך אך רוב תוצרי החיתוך מקורם באלל הנורמאלי MIR319 al. 2007.(et התוצאות מעידות כי LA מעודד הפסקת חלוקות תאים ודיפרנציאציה מהירה של MIR319 שולי העלה, וכי בקרה ע"י משפיעה על אורך חלון הזמן שבו מתקיימת פעילות מורפוגנטית בשולי העלה. בעגבנייה נמצאו עדויות כי התפתחות עלה מורכב קשורה במשך הזמן בו פעיל ה- blastozone,marginal כך שחלון מורפוגנטי ארוך מאפשר פעילות בשולי העלה ויצירת עלעלים 2007) al..(ori et בארבידופסיס נמצאו גנים רבים השייכים למשפחת (2007 al..(koyama et ה- TCP הראה ביטוי במריסטמה ובצינורות ההובלה בעובר ובנבט, לעומת זאת הביטוי ptcp3:gus הסופי של הגן TCP3 הוא באזור הדיסטאלי של הפסיגים ללא ביטוי במריסטמה, מכאן שיש Palatnik et al. ) MIR319 מנגנונים המבקרים את TCP3 לאחר השעתוק, למשל חיתוך ע"י בצמחי ארבידופסיס המבטאים את הרצף -TCP3SRDX הגן.(2003; Koyama et al. 2007 שאליו מחובר רפרסור, התקבלה עליה של הגנים CUC1 ו- CUC2, ועיכוב של mir164 TCP3

28 al. 2007.(Koyama et בצמחים אלו התקבלו תאים קטנים ועגולים בשולי העלה, העלים היו מסולסלים והתפתחו נצרים אקטופיים על הצד האדקסיאלי של הפסיגים. פנוטיפים אלה דומים.(Takada et al. 2001, Hibara et al. 2003) לצמחים המבטאים ביתר את CUC1 החוקרים הסיקו שפקטורי שעתוק ממשפחת TCP משפיעים על המורפוגנזה ע"י עיכוב של גני גבול ובתוכם.(Koyama et al. 2007) עידוד של ביטוי MIR164 דרך ו- CUC2, CUC1 KNOTTED-like homeobox (KNOX I).6.2 למשפחת KNOXI בארבידופסיס שייכים ארבעה פקטורי שעתוק: SHOOTMERISTEMLESS,KNAT6,KNOTTED-like from Arabidopsis thaliana2 (KNAT2),(STM) (BP),BREVIPEDICELLUS הפעילים בהתפתחות ושמירה על פעילות המריסטמה הקודקודית של הנצר 2004) al. STM.(Hake et ו- BP פעילים בשימור מצב לא ממוין של התאים באזור stm1 המרכזי במריסטמת הנצר. STM מתבטא בפס צר בין הפסיגים בעובר, והמוטנט חסר מריסטמה ומייצר שני פסיגים מאוחים. CUC2 ו- STM מתבטאים בדפוס חופף בשלבי העובר המוקדמים, ובשלב העובר הכפוף הגנים מתבטאים באזורים שונים- הגן STM באזור המריסטמה.(Aida et al. 1999) העתידית, ו- CUC2 בגבול שבין המריסטמה לפסיגים החוקרים הציעו כי CUC2 יצירת המריסטמה הקודקודית של הנצר בעובר דורשת שני שלבים. בשלב הראשון מתבטא בפס צר בין הפסיגים. בשלב השני STM מאוקטב ישירות או בעקיפין ע"י CUC2 ומתחיל STM את שרשרת התהליכים באזור שיתפתח למריסטמה הקודקודית של הנצר. לעומת זאת.(Daimon et al. 2003) דרוש ליצירת נצרים בתרבית במסלול שבו פעיל CUC הגן KNAT6 מתבטא בעובר, בגבול שבין המריסטמה של הנצר והפרימורדיה שבשוליה, מאוחר יותר מביטוי STM ו- CUC, ו- KNAT2 מתבטא באזור rib zone במריסטמה של הנצר ) al. Pautot et al. 2006.(2001; Belles-Boix et במוטנט המשולש stm-2 knat6 cuc3 מתקבלת החמרה של פנוטיפ stm-2 knat6 המתבטאת בהרחבת בסיס האיחוי לצורת גביע. החוקרים הסיקו ש- CUC3 cuc1 cuc2 לא חשוב במיוחד להפרדת הפסיגים (2006 al..(belles-boix et במוטנט הכפול

29.CUC והחוקרים הסיקו כי ביטוי KNAT6 תלוי הוא,pKNAT6:GUS בצמחים המבטאים 35S:BP וגן מדווח המחקה את דגם הביטוי של,(WET368) CUC3 נמצא כי Vroemen ) 35S:BP מתבטא בגבולות המריסטמות האקטופיות שהתפתחו על העלים של CUC3 al. 2003.(et ביטוי הגן המדווח בגבולות האקטופים נראתה לפני שנראו מריסטמות על העלים, כלומר הגדרת הגבול מקדימה ואולי נחוצה להתארגנות מריסטמה אקטופית. גנים לסיכום, ממשפחת CUC וגנים ממשפחת KNOXI משמרים את המצב הבלתי ממוין של התאים באזורים שונים של המריסטמה הקודקודית של הנצר, כתוצאה מביטוי במתחמים שונים. חלבוני KNOXI, CUC משמרים מאגר תאים ליצירת איברים, בעוד חלבוני מעכבים גדילה ומגדירים גבול המבדיל בין אזור ביטוי KNOXI לאזור יצירת איברים חדשים. ENHANCER OF SHOOT REGENERATION 2 (ESR2).6.3 ESR2 הוא פקטור שעתוק ממשפחת,AP2/ERF הפעיל בתהליך הרגנרציה של נצרים בתרבית. pesr2.(ikeda et al. 2006) ביטוי ביתר של ESR2 מעודד רגנרציה ללא תלות בציטוקינין מתבטא בקצות הפסיגים, ובשלב העובר הכפוף מתבטא גם במריסטמה בין הפסיגים. בסריקה לגנים אשר מושפעים ישירות מביטוי,ESR2 נמצאה עלייה בביטוי הגן CUC1 בקורלציה למידת RNAi החומרה של פנוטיפ צמחים המבטאים ביתר את.ESR2 השתקה של ESR2 ע"י הביאה לאיחוי חלקי של הפסיגים, פנוטיפ דומה למוטנט.cuc1 נראה כי ESR2 מבקר חיובית את CUC1 אך אין לו השפעה על ביטוי CUC2 בתנאים וברקמות שנבדקו. JAGGED(JAG).6.4 JAG הוא פקטור שעתוק השייך למשפחת zinc-finger בארבידופסיס. בעובר מתבטא JAG בתאים הממוקמים בפרימורדית הפסיג המתפתח, וחסר במריסטמה הקודקודית של הנצר. בפרימורדית העלה הביטוי מתרכז בחלק הדיסטאלי (2004 al..(ohno et בפרח JAG מתבטא

30 במוטנט jag נצפו שינויים מורפולוגיים בכל האיברים הצדדיים שהתפתחו שולי העלים מראים אונות, עלי הגביע והכותרת.(Ohno et al. 2004, Dinneny et al. 2004) קטנים ובקצותיהם קיים שינון. חלוקת תאים בעלי הכותרת שבמוטנט, מסתיימת מוקדם יותר מאשר ב- WT, כפי שנמצא בבחינה של ביטוי בגן המקודד.(Dinneny et al. (2004 HISTONE4 בעלה של המוטנט הדומיננטי jag-5d מתפתחת רקמת עלה באזור הפטוטרת, ואין הפרדה ברורה בין הטרף לפטוטרת. בתפרחות נראית גדילה של עלה החפה,(bract) שבחיקו נוצר הפרח ובאופן נורמאלי הוא מעוכב ולא נראה. בהומוזיגוט ישנן תפרחות בעלות אופי וגטטיבי shoot).(leafy ביטוי 35S:JAG הביא לנבטים המראים רמות שונות של איחוי הפסיגים, ושיבוש של מערכת צינורות ההובלה ומבנה העלה (2004 al..(ohno et הגן JAG דרוש לחלוקות תאים מתואמות והתרחבות במהלך התפתחות האיברים הצדדיים, ומעכב את הפסקת החלוקות באזור הדיסטאלי עד שתהליכים מורפוגנטיים יסתיימו 2004) al..(ohno et al. 2004; Dinneny et מוטנט המשולש cuc1 cuc2 jag הראה פנוטיפ פחות חמור בהשוואה למוטנט הכפול,cuc1 cuc2 והוא Xu et al. 2008 הגיע לפריחה 2008) al..(xu et הסיקו ש- JAG מאפשר התפתחות נורמאלית של עלי הגביע ועלי הכותרת ע"י הגבלת איזור הביטוי של CUC1 ו- CUC2. ASYMMETRIC LEAVES 1, 2 (AS1, AS2).6.5 הגנים AS1, AS2 מארבידופסיס מתבטאים בפרימורדית העלה, ומעכבים גנים מריסטמטים בפרח AS1.(Ori et al. 2000; Guo et al. 2008) ממשפחת KNOXI ו- AS2 משפיעים על גודל עלי הגביע ועלי הכותרת ובמוטנטים as1, as2 יש ירידה בגודלם. AS1 מתבטא בכל איברי הפרח (2000 al.,(byrne et ו- AS2 מתבטא בצד האדאקסיאלי של עלי הגביע, באבקנים ובפנים השחלה cuc1 cuc2 המוטנט as1 מתקן את איחוי הפסיגים של המוטנט הכפול.(Xu et al. 2008) ומאפשר התפתחות פרחים על הצמח 2008) al..(hibara et al. 2003, Xu et בפרח של המוטנטים הכפולים as1 jag, as2 jag יש ירידה בגודל עלי הגביע ועלי הכותרת. בעלי הגביע של פרחים אלה נצפתה ירידה בחלוקות תאים ועלייה בביטוי.(Xu et al. (2008 CUC1, CUC2

31 ו- AS2 מאפשר התפתחות נורמאלית של עלי הגביע ועלי הכותרת ע"י AS1 הגבלת איזור הביטוי של CUC1 ו- CUC2. PIN FORMED1 (PIN)1, PINOID (PID).6.6 pin1 הגן (PIN)1 PIN FORMED1 פעיל בקביעת התנועה הפולארית של האוקסין. במוטנט כחצי מהנבטים מראים איחוי פסיגים חלקי, בהמשך נוצרים פחות עלי שושנת והתפרחת pin1 מסתיימת ללא יצירת פרחים, בגבעול דמוי מקל (2000 al..(vernoux et בעובר מתרחב cuc1 pin1 הביטוי של CUC1 אל הפסיגים, ומוטנט כפול הראה איחוי של הפסיגים בכל cuc2 CUC2 הנבטים.,pin1 בעובר ביטוי יורד ומתרכז באזור שבין הפסיגים, ומוטנט כפול הראה פנוטיפ דומה למוטנט pin1 pin1 אך עם עלייה ניכרת בתדירות איחוי חלקי של הפסיגים PIN1 תוצאות אלו מעידות כי לירידה בפעילות השפעה שונה על ביטוי.(Aida et al. 2002) CUC1 ו- CUC2. במריסטמת פריחה נורמאלית של ארבידופסיס הגן CUC2 מסמן את הגבולות CUC2 pin1 שבין הדורים בפרח, לעומת זאת, במריסטמה של המוטנט הגן מתבטא בטבעת רחבה סביב המריסטמה, ובחפיפה עם מרקרים של פרח. al. 2000 Vernoux et הסיקו שהשינוי PINOID בדגם הביטוי נובע מכך שבמוטנט pin1 אין הבדלה בין תאי גבול ותאי פרימורדיה. (PID) מתבטא בקבוצות תאים המסמנות את הפרימורדיות העתידיות של הפרחים במוטנט pid1 נראה שינוי במספר הפסיגים.(Christensen et al. 2000; Friml et al. 2004) Furutani et al. ) הנובע מגדילה אסימטרית או מיקום שונה של הפסיגים ביחס למריסטמה 2004). במוטנט pin1 pid נראתה הרחבה יציבה של ביטוי CUC1 אל שולי המריסטמה העוברית, pin1 pid וביטוי CUC2 גדל מעט יחסית לביטוי במוטנט.pin1 המוטנט הכפול מראה פנוטיפ שבו לא נוצרים פסיגים במקרה החמור, ונבטים שבהם מתפתחים פסיגים מרובים וקטנים בתחילה, ומאוחר יותר מתפתחים בהם פרימורדיות עלים שמראים איחוי ופגיעה בפילוטקסיס 2004) al..(furutani et במוטנטים המשולשים cuc1 pin1 pid ן- pid cuc2 pin1 יש החלשה של הפנוטיפ הנראה במוטנט, pin1 pid ומתקבלת גדילה מסוימת של הפסיגים. תוצאות אלו מעידות כי חוסר התפתחות הפסיגים במוטנט הכפול pin1 pid נובע מהתפשטות ביטוי CUC1

32 al. 2004.(Furutani et תוצאות אלו מרמזות כי התנועה הפולארית ופיזור האוקסין משפיעות על התפתחות האיברים על ידי בקרה על ביטוי גני הגבול CUC1 ו- CUC2, או שזוהי השפעה עקיפה. 7. אוקסין אוקסין הוא הורמון בעל תפקיד מרכזי בתהליכים התפתחותיים וקביעת צורה בצמח ) Benkova Indol-3-Acetic Acid.(et al. 2003; Woodward and Bartel 2005; Wang et al. 2005 (IAA) היא הצורה הטבעית העיקרית של האוקסין. השפעת האוקסין על תהליכי גדילה נעשית דרך בקרה על ביטוי גנים, המובילה לשינוי בתהליכי התמיינות והתפתחות. בין התהליכים המושפעים מאוקסין: התפתחות שורשים צדדיים, קביעת ציר העובר, פילוטקסיס, התפתחות צינורות ההובלה וטרופיזם 2006) al..(woodward an d Bartel 2005; Scarpella et ייצור אוקסין יכול להתבצע ברקמות שונות, והמרחק בין נקודת הייצור לאזור בו תתבצע התמיינות של מערכת העצה והשיפה משפיע על צפיפות ופיזור צינורות ההובלה (2003 al..(aloni et מניחים Avsian-kretchmer et al. ) שרוב האוקסין מיוצר בעלים צעירים שסיימו להתרחב ובפסיגים מקובל כי הובלת אוקסין מהווה גורם מרכזי בבקרת פעילותו והשפעתו על ההתפתחות.(2002 הנורמאלית של הצמח. בארבידופסיס נחקרו הגורמים המעורבים בשלבים השונים של יצור והובלת אוקסין. Aux1 הוא חלבון ממברנלי אשר משתתף בהכנסת האוקסין אל התא, ממוקם בצורה אסימטרית בממברנה של תאים מסוימים, ולכן מאפשר תנועה כיוונית ) al. Kramer et al. 2007 PIN-FORMED1 (PIN1).(2006; Boutte et הוא חלבון המתפקד כנשא של אוקסין, הממוקם בסידור אסימטרי בממברנת התא בכיוון תנועת שטף האוקסין (2003 al..(benkova et PIN החלבון PIN1 שייך למשפחת חלבונים גדולה. מיקומם התוך תאי של חלבוני הוא גמיש ומורכב, ומבוקר על ידי תנועה דינאמית בין הממברנה לשלפוחיות תוך תאיות, תוך תלות באקטין. מיקום PIN1 מושפע מ-( PID ) PINOID שהוא קינאז, וביטוי ביתר של PID מראה פנוטיפים של חוסר רגישות לאוקסין 2000) al..(christensen et החלבון PROTEIN PHOSPHATASE 2A

33 (PP2A) מראה חפיפה למיקום התוך תאי של חלבוני,PIN וכנראה משפיע על מצב הזירחון של חלבוני,PIN וכך מבקר את המיקום הפולארי שלהם בתא (2007 al..(michniewicz et הציע את,Canalization Theory המתארת הגבלה הדרגתית של האוקסין משדה Sachs1981 תאים נרחב לשורת תאים מוגדרת. בהתאם לגראדינט האוקסין, הנוצר מהגבלת שטף האוקסין, מתפתחים צינורות ההובלה, המקשרים את האיבר החדש עם מערכת ההובלה הקיימת ומשפיעים על צורתו (1981.(Sachs האוקסין מובל אל אזור המריסטמה הקודקודית בשכבה החיצונית של הנצר, ומצטבר בקצה הפרימורדיה, שם הוא משפיע על מיקום יצירת האיברים הצדדיים 2003) al..(reinhardt et al. 2000; Benkova et יצירת הפרימורדיום משנה את כיוון שטף האוקסין אל שכבות התאים הפנימיות של הפרימורדיום, וכך קובע את מיקום צינורות ההובלה אשר מקשרים את האיבר החדש למערכת ההובלה של הצמח. בגבעול האוקסין מובל בצורה באזיפטאלית ומעכב גדילה של ניצנים צדדיים. עלייה ברמת האוקסין מביאה לשעתוק של גנים רבים השייכים לשלוש משפחות עיקריות:.SAUR, GH3, AUX/IAA שעתוק של גנים ממשפחת AUX/IAA בתגובה לאוקסין הוא מהיר Gain Of Function (GOF) ואינו דורש סינתזה של חלבונים מחדש. מוטציות בחלבוני AUX/IAA מביאות ברוב המקרים לירידה ברגישות לאוקסין ומראות שינויים התפתחותיים בשלבים שונים. בניגוד לכך, מוטציות שמבטלות את פעילות החלבון מראות פנוטיפים חלשים יחסית המוסברים על ידי החפיפה התפקודית בין הגנים במשפחת Woodward and ) AUX/IAA (conserved החלבונים השייכים למשפחה זו מכילים ארבעה אזורים שמורים.(Bartel 2005 שמראים רמת שימור גבוהה בין מיני צמחים שונים. האזור הראשון מתפקד,domains I-IV) כמעכב שעתוק. II איזור חשוב ליציבות של החלבונים ומוטציות באזור זה בודדו כ- GOF, המייצב את החלבון ומביא לחוסר רגישות לאוקסין. III אזורים ו- IV מתפקדים בהומודימריזציה והטרודימריזציה של חלבונים במשפחה וקישור לחלבוני AUXIN משפחת חלבוני ARF משמשים כמתווכים בין האוקסין.RESPONSE FACTORS (ARF) לבקרת השעתוק של גני המטרה, והם מתפקדים כנראה כמעכבי או כמשפעלי תגובה לאוקסין. למוטנטים בגנים ממשפחת ARF יש פגמים בשלבי התפתחות שונים כגון התפתחות הפרח והנבט. ARF חלבוני AUX/IAA מעכבים את חלבוני בזמן שאין אוקסין ברקמה, ועם עליית רמת

34 AUX/IAA והעברת סיגנאל האוקסין. חלבוני AUX/IAA אינם יציבים כיוון שהם משמשים כסובסטראט לקומפלקס,SCF TIR1 ubiquitin- ligase המבקר את סיגנאל האוקסין ע"י סימון חלבוני AUX/IAA במולקולות ubiquitin המביא לפירוקם. SCF TIR1 הוא חלבון גרעיני קטן, שזוהה כרצפטור של האוקסין ושייך לקומפלקס TIR1.ubiquitin-ligase לאחרונה פוענח המבנה המרחבי של,TIR1 והקישור שלו לאוקסין ולחלבוני,AUX/IAA ונמצא כי אוקסין משמש כ"דבק" בין TIR1 לחלבוני,AUX/IAA ואינו משנה את המבנה המרחבי של.(Tan et al. 2007) TIR1

35 שיטות וחומרים 1. עבודה עם חומצות גרעין.1.1 הפקת DNA רקמה במשקל של 150-200mg נאספה מעלים של צמחים צעירים. הרקמה נטחנה בתוך 350μl 20 350μl בופר הפקת DNA ואחר כך הוספו נוספים. המבחנה הודגרה ב- C 60 o במשך דקות, אחר כך הוספו 700μl כלורופורם אוקטנול (1:24). המבחנה סורכזה במשך 5 דקות במהירות של 13,000rpm ונלקחה הפאזה העליונה למבחנה חדשה, והוסף נפח שווה של איזופרופנול. המבחנה הודגרה ב- 4 C למשך 15 דקות עד לילה, ואחר-כך סורכזה במשך 5 דקות במהירות.13,000rpm הפלט נשטף באתנול 75%, יובש והורחף ב 100μlמים..1.2 הפקת RNA דגימת צמח במשקל 100-500mg הוקפאה בחנקן נוזלי, ונכתשה לאבקה דקה שהועברה למבחנה GHC המכילה 400μl של בופר קר. המבחנה עברה ערבוב בוורטקס למשך מספר שניות ומיד לאחר מכן הוספו למבחנה 400μl של פנול:כלורופורם ph=4.7 1:5.(SIGMA) המבחנה עורבבה בוורטקס והודגרה בקרח למשך 30 דקות לפחות. המבחנה סורכזה במשך 30-60 דקות במהירות 13,400rpm בטמפרטורת החדר. הפאזה העליונה (350μl) נשפתה למבחנה חדשה אליה הוסף נפח.(70μl) המבחנה עורבבה 1M ו- 0.2 נפח של חומצה אצטית (245μl) קר 100% Ethanol של 0.7 10 בוורטקס והודגרה למשך לילה בטמפרטורה של 80 C-. המבחנה סורכזה במשך דקות 3M NaAc 4 C במהירות 13,400rpm בטמפרטורה של לצורך שיקוע. הפלט נשטף ב- 500μl המבחנה עורבבה בוורטקס במשך שניות וסורכזה במשך 5 דקות במהירות 15-30,(pH5.5) בטמפרטורה של הפלט נשטף ב- 500μl 70% Ethanol קר והמבחנה סורכזה.4 C 13,400rpm.RNase free water שוב למשך דקה, ואז הפלט יובש והורחף ב- 50μl לצורך קבלת תמיסה הומוגנית הודגרה המבחנה במשך 10 דקות ב- 65 C, והפלט הורחף בצורה אחידה על ידי פיפטציה. לפני מדידת ריכוז ה- RNA סורכזה המבחנה במשך דקה במהירות של.13,400rpm

36.1.3 הכנת cdna (ABgene) Reverse-iT הוכן מ- 5μg RNA באמצעות הקיט עפ"י פרוטוקול היצרן, cdna ושימוש בפריימר Oligo-dT בכדי להגביר את כל התעתיקים. PCR, RT-PCR.1.4 ריאקצית ה- PCRR התבצעה במכשיר T3 thermocycler,(biometra) ונעשה שימוש באנזים Taq 1μl עם המרכיבים הבאים:,20µl הריאקציה בוצעה בנפח של (טלרון). Zol DNA Polymerase 0.2mM,0.25mM dntps X10 5μl צמחי, 1.5units אנזים, בופר, מכל תחל ספציפי DNA והשלמת הנפח עם מים מזוקקים פעמיים. בריאקצית RT-PCR נלקחו 2µl של.cDNA תנאי ריאקצית ה- :PCR 94 C למשך 5 דקות. 94 C למשך 45 שניות. 50-65 C, בהתאם ל- Tm של התחל, למשך 45 שניות. 72 C למשך 30-120 שניות, בהתאם לאורך התוצר (כדקה לכל 1000 בסיסים). 30 חזרות לשלבים 4-2. 72 C למשך 10 דקות. עד הוצאת הדוגמאות ממכשיר ה- PCRR. 10 C.1.2.3.4.5.6.7

37 רצף התחל CTCGAGATGGAGATTTTCATCAGATGC GGATCCTCAGTAGCTCCACATACAGTT CAAG שם התחל GOBstart GOBstop מיקום התחל/מטרה קצה 5' בגן GOB קצה 3' בגן GOB Prom L' קצה 5' מקטע של AGTCGACTCGAGTGACTTCGTATCTTT הפרומוטר CGTC Prom R' קצה 3' מקטע של GGTAAAAAAAAGGCTAACACCACGGT הפרומוטר CGAC '5126F מקיפים את אזור החסר GCCAACTCCAAGTTTCGCTTC 5126R' באלל n5126 של GATTAGAAAATCCGCCGTGCAT GR-RNA oligo IAA9-LEFT IAA9-RIGHT המוטנט gob RLM-RACE תחילת ORF סוף ORF CGACUGGAGCACGAGGACACUG GAGGAGGAGGGCCAGAGTAAT GAAAAGTGTCGGAGCAGAAAT טבלה 1. התחלים ששימשו לעבודה 1.5. ריצוף תוצרי PCR QIAex II Gel במטרה לקבוע את רצף תוצרי,PCR התוצרים הורצו בג'ל ונוקו באמצעות הריצוף נעשה במכשיר,ABI 3700 DNA Analyzer במרכז.Extraction kit (QIAGEN) לטכנולוגיות גנומיות ע"י מירה קורנר (אוניברסיטה העברית בירושלים). ארגון והשוואת רצפים נערכה בעזרת התוכנה.Sequencher 4.1

38 1.6. שיבוטים ובניית פלסמידים במטרה לשבט את הפרומוטר של הגן GOB הושווה הרצף גנומי של קצה 5' של הגן GOB לרצפים SL_EcoRI0127N16 BAC.NCBI BLAST הקיימים במאגר המידע SGN בעזרת תוכנת הראה נוכחות של מקטע מהגן GOB בקצהו, באוריינטציה שבה נמצאת תחילת הרצף המקודד בקצה ה- BAC, כלומר הרצף שנמצא במעלה הזרם לגן GOB קיים ב- BAC (תמונה 2 ). חיידקים.Jim Giovannoni SL_EcoRI0127N16 אשר מכילים את BAC התקבלו מ- תת-ספרייה המכילה מקטעים קצרים יוצרה ע"י חיתוך ה- DNA למקטעים קטנים ושיבוטם לפלסמיד.pBS ספרייה זו נסרקה עם פרוב רדיואקטיבי מתוך תחילת הרצף המקודד, ומושבות חיוביות נשלחו לריצוף. הריצוף העלה מקטע של 2300 בסיסים (סומן,(pGOB ורצף pgob שובט למערכת של טרנסאקטיבציה לפני רצף LhG4 ליצירת הפלסמיד.pGOB-LhG4 GOB במטרה לבחון את השפעת השינויים ברצף אתר ההכרה של mir164 בגן על צורת העלים,GOB wt, GOB 4d, GOB m ופנוטיפ הצמח, יוצרו הרצפים הכוללים שינויים ברצף ההכרה של.(A בגן,GOB אך ללא שינוי ברצף החלבון (תמונה 1 השינויים ברצף יוצרו ע"י mir164,part27,10:op ריאקצית PCR והגן השלם חובר לרצף אשר הועבר לפלסמיד אשר מכיל PCR עמידות לקנמיצין כסמן סלקציה. רצפי הגנים GOB wt, GOB 4d שובטו ע"י ריאקצית על PCR GOB m Gob-4d שהופק מצמח M82, בהתאמה. רצף שובט ע"י ריאקצית על cdna מצמח M82 בשני שלבים. בשלב הראשון נעשו שתי ריאקציות נפרדות על שני חלקי הגן cdna כך שבכל ריאקציה ישנו תחל אחד הנושא את השינויים הרצויים באזור הקישור של mir164 GOBmF') או,(GOBmR' ותחל מקצה הגן GOBstart) או (GOBstop (תמונה 1 B). בשלב השני נוקו תוצרי הריאקציות ועורבבו ביחס של 1:1. על תערובת התוצרים נערכה ריאקצית PCR עם שני התחלים הקיצוניים כך שהתוצר מכיל את כל הרצף המקודד של GOB עם השינויים TOPO PCRII הדרושים. GOB רצפי השונים שובטו לפלסמיד ונבדקו בריצוף. מערכת הטרנסאקטיבציה שימשה לביטוי הגנים השונים בעזרת פרומוטרים שונים (1998 al..(moore et רצפי הגנים GOB m,gob 4d,GOB wt שובטו בהמשך רצף 10:op בפלסמיד.BJ36 בשלב הסופי

39 ) op:gene או ( promoter-lhg4 הועברה לפלסמיד בינארי part7 המכיל עמידות לקנמיצין כסמן סלקציה בצמחים. תמונה 1. רצפי הגן GOB בצמחים הטרנסגנים, ומהלך הכנת רצף. A. GOB m השינויים שהוכנסו ברצף בהשוואה לרצף הנורמאלי.. B מהלך הכנת רצף.GOB m תעתיק הגן GOB מסומן בריבוע אפור. הקווים העבים מסמנים את תוצרי הריאקציה הראשונה, הקו המקווקו מסמן את תוצר הריאקציה השניה. החיצים מסמנים את כיוון ומיקום התחלים. RNA ligase-mediated rapid Amplification of cdna Ends (RLM-RACE). 1.7 ריאקצית RLM-RACE נעשתה לפי al. 2007 RNA. Ori et שהופק מגנוטיפים שונים עבר ליגציה לרצף RNA קצר oligo-rna) ). לאחר מכן נערכה ריאקצית RT-PCR עם תחל ספציפי ל- oligo-rna ותחל מהגן. GOB תוצרי ה PCR- שהתקבלו נוקו ושובטו לפלסמיד TOPO, PCRII שעבר טרנספורמציה לחיידקי.E.coli מכל גנוטיפ נשלחו לריצוף מספר מושבות, שהופקו

40, GOB ונקבע הבסיס שבו חובר תעתיק הגן GOB ל -. בסיס זה מזהה את הנקודה בה נחתך תעתיק הגן ע"י קומפלקס mir164. oligo-rna תמונה תעתיק הגן 2. מהלך ריאקצית RLM-RACE לזיהוי הבקרה של mir164 על. GOB בחלק 1 נראה GOB השלם מסומן בריבוע אפור. 2 בחלק נראה תעתיק הגן לאחר החיתוך ע"י mir164 וחיבור. Oligo-RNA הקו העבה מסמן את תוצר ריאקצית ה PCR-. החיצים מסמנים את כיוון ומיקום התחלים. הריבוע המפוספס מסמן את ה- Oligo-RNA שחובר לRNA. In Vitro Transcription. 1.8 פלסמיד, TOPO PCRII המכיל את רצף הגלאי GOB נחתך באנזים רסטריקציה החותך בקצה 5' של רצף הגלאי. לאחר מכן נוקה הפלסמיד ע"י פנולציה והורחף במים. ריאקציה השעתוק, בנפח סופי של 25µl כללה : 5µl בופר 5µl, X5 בסיסים, 6.25 µl DIG-UTP, 0.625 µl UTP) X5 T7 RNA polymerase ומשאר הבסיסים 1.25 µl בנפח סופי של 0.6µl, ( 50 µl מעכב רנא"ז, 4µg, 0.7µl פלסמיד חתוך. הריאקציה נמשכה 30-60 דקות בטמפרטורה של. 37 תוצרי ), והגלאי נשמר ב -70 -. GE Healthcare) השעתוק נוקו בקולונה G50 2. שיטות עבודה עם חיידקים.2.1 טרנספורמציה לחיידקי Escherichia coli מבחנת תאי.E coli קומפטנטיים הופשרה בקרח ואליה הוסף 1μlפלסמיד. התמיסה הודגרה בקרח במשך 30 דקות, חוממה ב- 42 C למשך כ- 60 שניות והודגרה בקרח למשך 5 דקות נוספות. לחיידקים הוספו 450μl של מצע LB נוזלי ללא אנטיביוטיקה והמבחנה הודגרה כשעה בטלטול

41 60) rpm בטמפרטורה של 37 C. החיידקים נזרעו על גבי צלחות LB עם האנטיביוטיקה המתאימה למשך הלילה ב- 37 C..2.2 טרנספורמציה לחיידקי Agrobacterium tumefaciens A. tumefaciens מבחנה המכילה 100µl תאי קומפטנטיים הופשרה בקרח, ואליה הוסף 1μlפלסמיד. החיידקים שעורבבו עם הפלסמיד הועברו לקיווטה, שהוכנסה למכשיר אלקטרופורציה. זרם הועבר דרך הקיווטה, ולאחר מכן החיידקים הוחזרו למבחנה. לחיידקים הוספו 450μl של מצע LB נוזלי ללא אנטיביוטיקה והמבחנה הודגרה כשעתיים בטלטול עדין ) 60 (rpm בטמפרטורה של 28 C. החיידקים נזרעו על גבי צלחות LB עם האנטיביוטיקה המתאימה למשך 48 שעות, ב- 28 C. 2.3. הפקת פלסמיד מחיידקים QIAprep Spin פלסמיד הופק מתרבית חיידקי,E.coli שגודלה לילה ב- 37, באמצעות.Miniprep Kit 3. צמחי עגבנייה 3.1. גידול והכלאות צמחי עגבנייה גודלו בעונת החורף בחממה מחוממת ובעונת הקיץ בשדה פתוח. צמחים טרנסגנים גודלו בקיץ בחממה בטמפרטורה של 25º ביום ארוך או בעונת החורף בטמפרטורה ואורך יום In Situ Hybridization RNA טבעי. צמחים שנאספו להפקת או לקיבוע לאנליזת גודלו בתא צמיחה בטמפרטורה של 25º ביום ארוך. הכלאה נעשתה ע"י סירוס פרח בעל עלי כותרת בצבע לימוני חיוור והנחת אבקה מצמח אחר. ההכלאות סומנו על מנת שיהיה קל לזהות את הפרי תוצאת ההכלאה ולוודא את זהות ההורים. ההכלאות שנערכו:.(PCR תוצאות (לפי gob1/+ שהיו הטרוזיגוטים ונאספו זרעים מצמחי F1,gob1/+ x e/e 1.

42 שהראו פנוטיפ.pFIL>miR164 ונאספו זרעים מצמחי F1,pFIL>>mir164/+ x e/e.2 Gob-4d ונאספו זרעים מצמחי F1 שהיו הטרוזיגוטים (כיוון,Gob-4d/Gob-4d x e/e.3 שהומוזיגוט Gob-4d אינו מייצר זרעים)..Gob-4d שהיו הטרוזיגוטים ונאספו זרעים מצמחי F1,Gob-4d/Gob-4d x lyr/lyr.4 שהראו פנוטיפ.pFIL>miR164 ונאספו זרעים מצמחי F1,pFIL>>mir164 x lyr/lyr.5 F1 הכלאות נערכו בין קווי פרומוטרים לקווי op:gene ותוצרי ההכלאה נבחנו בדור על ידי צביעת GUS או על ידי מעקב פנוטיפי והשוואה לצמח.WT 3.2. הפקת זרעים הפירות נאספו בשלב הבשלה בו הפרי אדום, הפרי נחתך ותוכן המגורות נאסף לשקית רשת. השקית הונחה בכלי המכיל נוזל מהפרי ותמיסת סוכרוז 1%, להתססה במשך יום בטמפרטורה של 37 C. לאחר מכן נשטפה השקית תחת מים זורמים והזרעים חוטאו בתמיסת sodium- 5% hypochlorite למשך 10 דקות ונשטפו שנית במים זורמים. המשך החיטוי נעשה בתמיסת 10% phosphate-12-hydrate) TSP (tri-sodium למשך 10 דקות ושטיפה תחת מים זורמים. הזרעים יובשו בטמפרטורת החדר ונשמרו בשקיות נייר. 3.3. מקור הצמחים Gob-4d,gob-1-3,lyr-1 קווי המוטנטים 2-4-e, נמצאו באוכלוסיית המוטנטים שיוצרה e1(la2922),lyr2(la2923) במעבדתו של פרופ' דני זמיר. המוטנטים התקבלו מ- TGRC pgob,gob m,gob 4d הקווים הטרנסגנים,GOB wt יוצרו בעבודה זו,.(tgrc.ucdavis.edu),op:GUS,pFIL,op:GUS,op:mir164 במעבדה של דר' נעמי אורי. הקווים הטרנסגנים p35scamv,op:gfp יוצרו במעבדה של פרופ' יובל אשד (מכון וייצמן)..

43 4. צמחים טרנסגנים 4.1. תרביות רקמה בצמחי עגבנייה M82 יצירת צמחים טרנסגנים נעשתה לפי al. 2006 Alvarez et על עגבנייה מזן מסיים.(sp-) feeder נבטי עגבנייה בני 10 ימים נקצרו והפסיגים נחתכו והונחו צפופים על מצע ללילה, 20 JV3101 בטמפרטורה של 20º בחושך. הפסיגים הודבקו בתמיסת אגרובקטריום מזן למשך דקות ואז הוספגו על נייר וואטמן והוחזרו ליומיים למצע feeder בחושך. ביום הרביעי הפסיגים.JII הועברו למצע JI למשך שבועיים ולאחר מכך הפסיגים הועברו למצע המצע הוחלף כל שבועיים עד שהתקבלו צמחונים שנותקו מהפסיג והועברו למצע JIII להמשך גדילה. צמחונים מבוססים הועברו למצע השרשה. צמחים בעלי שורש מפותח הוצאו לקרקע ועברו הקשחה במשך שבוע עד חשיפה מלאה לאוויר. על צמחי T 0 נעשו הכלאות מחזירות עם אבקה של M82. הכלאה מחזירה היא הכלאה של הצמח הטרנסגני לצמח ממין הבר, במטרה להכליא החוצה אירועי ראורגניזציה שקרו במהלך הטרנספורמציה ותרבית הרקמה. הפירות נאספו לאחר שלב מפנה, והזרעים שהופקו נזרעו על מצע סלקציה (50mg/l),MS+ Kanamicin בכדי לזהות את הנבטים המכילים את המחדר. 4.2. טרנספורמציה של צמחי ארבידופסיס op:gus טרנספורמציה של צמחי ארבידופסיס המכילים את המחדר op:gfp או נעשתה ע"י טבילת התפרחות בתרחיף חיידקי אגרובקטריום, המכילים את המחדר,pGOB למשך 5 דקות. הצמחים הוחזרו להמשך גידול בחדר גידול (20º, יום ארוך). לאחר ייבוש מלא של התרמילים (300 mg/ml) 3-4 הזרעים נאספו ונזרעו. סלקציה נעשתה ע"י ריסוסים עוקבים של קנמיצין כאשר הנבטים היו בני שבוע. צמחי ארבידופסיס גודלו בחדר צמיחה בטמפרטורה של 20º ביום ארוך. צמחים המבטאים pcuc2>>gus התקבלו מיובל אשד (מכון וייצמן).

ב, 44 5. קיבוע רקמה וחתכים צמחי עגבנייה בני 10-15 יום קובעו לפי al. 2006.Pekker et מריסטמות של נבטים בני 10-14 יום, קובעו בתמיסת,FAA בקור וטלטול למשך לילה. הדוגמאות הועברו בהדרגה ל- 100% אתנול ואז נצבעו ב- eosin במשך לילה בטלטול. הדוגמאות נשטפו פעמיים ב- 100% אתנול ואז הועברו בהדרגה ל- 100% היסטוקליר (פינקלמן). הדוגמאות הושארו לילה בהיסטוקליר שאליו הוספו פתיתי שעווה Scientific).(McCormick לאחר מכן הדוגמאות הועברו לאינקובטור בטמפרטורה של 42º עד המסת השעווה, ואז הועברו לתנור 60º. השעווה הוחלפה 7 פעמים במהלך ארבעה ימים עוקבים. הדוגמאות והשעווה נמזגו לצלוחית שחוממה ל- 60º ואז קוררה לטמפרטורת חדר. 8µm קוביית השעווה שבהה הדוגמא הודבקה על משטח פלסטיק. החתכים בעובי נעשו.(Fisher Biotech) ProbeOn Plus במיקרוטום (LEICA) והועברו לזכוכית נושאת הדבקת החתכים לזכוכית נעשתה ע"י הצפת החתכים על,DEPC-H 2 O חימום הזכוכית הנושאת ל- 42º והוצאת המים לאחר 15 דקות. הזכוכית הושארה עד לייבוש מלא על פלטה מחוממת למשך לילה. In Situ Hybridization.6 ריאקצית in situ hybridization נערכה על מריסטמות שלמות ועל חתכים, והתוצאות שהתקבלו היו עקביות וזהות בשתי השיטות. בחינת הביטוי במריסטמה שלמה אפשרה למקד את דגם הביטוי בעלה, שהוא מבנה תלת מימדי ובחתכים בעלה בוגר קשה להיות בטוחים ברקמות הנראות בחתך, ואז מתאפשר אפיון חלקי בלבד של דגם הביטוי. GOB גלאי.Pekker et al. 2006 אנליזת In Situ Hybridization בוצעה על חתכים לפי סומן במולקולת DIG בריאקצית Exiqon נקנה מסומן מחברת גלאי mir164,in vitro transcription Locked-Nucleic-Acid-Incorporated DNA Probes יוצר בשיטת גלאי mir164.(denmark) אשר מעלה את היעילות של שימוש בגלאי קצר (21 בסיסים). החתכים נשטפו,(LNA probe) בהיסטוקליר ועברו הידרציה בגראדינט אתנול. לאחר מכן הדוגמאות עברו שטיפה ב- 2xSSC,.37º 30 וטיפול ב- Proteinase-k (Ambion) במשך דקות בטמפרטורה של בשלבים הבאים -4% פארפורמאלדהיד- החתכים נשטפו ב- Glycine-PBS 2%, ופעמיים בבופר (GIBCO) PBS ושוב פעמיים בבופר.PBS בשלב הבא השטיפה היא בתמיסת Triethanolamin-Acetic,PBS

45 ואז שתי שטיפות בבופר.PBS לסיום החתכים עברו דה-הידרציה בגראדינט עד,anhydride אתנול. 100% תמיסת ההיברידיזציה המכילה את הגלאי הונחה על זכוכית ואז זכוכית נוספת הוצמדה אליה כך שיש מרווח בין הזכוכיות והתמיסה מפוזרת בצורה אחידה בין הזכוכיות. היברידיזציה עם גלאי GOB נעשתה בטמפרטורה 55º, ב- 50% פורממיד. היברידיזציה עם גלאי mir164 נעשתה בטמפרטורה 46º ו- 60% פורממיד, למשך לילה. למחרת החתכים נשטפו פעמיים ובגלאי mir164,gob 55 למשך שעה ב- 0.2xSSC בטמפרטורה של אם הגלאי הוא השטיפה GOB הראשונה היא ב- 50% פורממיד ו- 1xSSC. לאחר מכן אם הגלאי הוא נעשה טיפול ב- 1% Boehringer החתכים טולטלו ב- block.0.2xssc ובופר,NTE ושטיפות בבופר,RNAse 45,BSA במשך 45 דקות בטלטול, ואז הועברו לבופר למשך דקות. זוגות זכוכיות (Roche) הוצמדו והנוגדן (Roche)Anti-Digoxigenin-AP בריכוז 1:1000, בבופר,BSA הועלה דיפוזית אל בין זוג זכוכיות נושאות שעליהן החתכים, והן הונחו לאינקובציה במשך שעתיים. הזכוכיות 15,BSA הופרדו ונשטפו שלוש פעמים 15 למשך בבופר דקות ואז נשטפו פעמיים, דקות ו- 10 דקות, בבופר הצביעה. תמיסת הצבע (Roche) BCIP/NBT הועלה דיפוזית לזוג זכוכיות נושאות שעליהן החתכים, והן הונחו לאינקובציה במשך לילה בטמפרטורת חדר, בחושך. ריאקצית הצבע נמשכה כ- 16 שעות בגלאי GOB ושלוש שעות בגלאי.miR164 הריאקציה הופסקה על ידי הפרדת הזכוכיות ושטיפתן במים. החתכים כוסו בזכוכית מכסה, אשר הודבקה עם דבק VectaMount.cell R וצולמו במיקרוסקופ Olympus 1X81 בתוכנת זכוכית,(Vector Laboratories) AQ מכסה. אנליזת Whole Mount In Situ נעשתה על עלים ומריסטמות שלמות לפי 2006. al. Hejátko et מריסטמות ועלים צעירים נאספו מנבטים בני 14 יום, קובעו בתמיסת,Fixative נשטפו פעמיים במתנול ושלוש פעמים באתנול ונשמרו לילה בקור. למחרת הדוגמאות נשטפו פעמיים באתנול ואז עברו הידרציה (75% אתנול, 50% אתנול, 25% אתנול ב- PBS ). הדוגמאות קובעו שוב ב- Fixative 125 ) ונשטפו פעמיים ב- Tween-PBS 0.1%. לאחר מכן טופלו הדוגמאות ב- Proteinase-k למשך 15 דקות, נשטפו ב- Glycine-PBS, ונשטפו פעמיים ב- Tween-PBS 0.1%. (µg/ml הדוגמאות קובעו שוב ב- Fixative ונשטפו פעמיים ב- Tween-PBS 0.1%. הדוגמאות נשטפו 10 דקות בתמיסת ההיברידיזציה, ואז טולטלו בתמיסת ההיברידיזציה ב- 55, למשך שעה.

46 בטלטול. 55 למחרת הדוגמאות נשטפו.(Tween 0.1%,2xSSC 50%) שלוש פעמים בשטיפת פורממיד ב- 55 פורממיד, הדוגמאות נשטפו ב- 55 בבופר,2xSSC) 0.1%) Tween למשך 20 דקות, ואז נשטפו פעמיים ב- 55 בבופר.(0.1% Tween אינקובציה,PBS) ואז שלוש פעמים ב- 25 בבופר 0.1%), Tween,0.2xSSC),(1% BSA,0.1% Tween מקדימה לנוגדן נעשתה ב- 25,PBS) בבופר והיברידיזציה עם הנוגדן נעשתה בבופר זהה שהוסף לו הנוגדן ואבקת מיצוי צמחי במשך לילה בחושך. למחרת ALP ואז נשטפו פעמיים בבופר 0.1%) Tween הדוגמאות נשטפו שמונה פעמים בבופר,PBS) 2mM Lavimasol ALP וריאקצית הצבע התבצעה בבופר בתוספת ותמיסה מוכנה של.(300µl/30ml buffer -Roche) BCIP/NBT משך הצביעה היה שעה בגלאי mir164 וחמש In Situ שעות בגלאי.GOB הגלאי, הנוגדן והסובסטראט בריאקצית הצבע זהים לאנליזת.Olympus שנעשה על חתכים. המריסטמות והעלים צולמו בבינוקולר SZX7 Hybridization.7 צביעת (GUS) ß-Glucoronidase צמחים או חלקי צמח הוכנסו לתמיסת GUS לואקום במשך 10 דקות ואז הועברו לאינקובציה ב- Olympus לזמנים שונים בהתאם לחוזק הצביעה. הצמחים צולמו שלמים בבינוקולר SZX7 37º או קובעו ונחתכו לשם צילום במיקרוסקופ Olympus1X81 בתוכנת.cell R Scanning Electron Micrograph (SEM).8 החומר הצמחי הועבר למבחנה המכילה תמיסת קיבוע: 3% גלוטרדיאלדהיד המהול ב- 25mM בופר פוספט.pH7 המבחנות הונחו ל- 10 דקות בדיסיקטור, תחת ואקום ולאחר מכן הועברו ל- 0.5% Osmium למשך הלילה. למחרת נשטפו הנבטים פעמיים בבופר הפוספט והועברו ל- 4 o C (אף הוא מהול בבופר הפוספט), למשך הלילה ב- C 4. o האוסמיום נוקז ובוצעו שתי tetroxide שטיפות בבופר הפוספט. הרקמה עברה תהליך דה-הידרציה ע"י סדרת שטיפות בריכוזים עולים של (30%, EtOH 50%, 65%, 75%, 89%, 95% וארבע שטיפות ב- 100% ), כל שטיפה כ- 20 דקות. הרקמה הושארה ב- 100% EtOH למשך הלילה ונשטפה פעמיים נוספות ב- EtOH 100%

47 SUPPLIES Microporous ) SPI Capsules,CPD לצורך (CPD).Critical Point Drying לאחר הייבוש במכשיר הדוגמאות (specimen הונחו על דסקיות נחושת והודבקו באמצעות דבק דו-צדדי, צופו בזהב. הדוגמאות נצפו וצולמו במיקרוסקופ.5410LV,(JSM) Jeol Scanning Microscope 9. מאגרי מידע BLAST רצפים נבחנו על ידי Tool) (Basic Local Alignment Search בעזרת מספר אתרים המרכזים את המידע המפורסם, על רצפי DNA והאנוטציה שלהם, באורגניזמים שונים. שיטת ה- DNA מאפשרת השוואת רצפים מרובים. מבחן ה- BLASTN מאפשר להשוות רצף BLAST לרצפי ה- DNA הידועים, וכמו כן, לקבוע את רמת ההומולוגיה ומובהקותה בין אותם רצפים. האתרים שבהם נבחנו רצפי ה- DNA הם: המרכז את הרצפים שידועים בעגבנייה, שבה תהליך -(http://www.sgn.cornell.edu/) SGN הריצוף של הגנום נמצא בעיצומו. באתר זה ניתן למצוא פרוט על המוטנטים השונים הידועים בעגבנייה. -(http://www.arabidopsis.org/blast/) TAIR המרכז את רצפי הארבידופסיס. (/http://www.tigr.org/tdb/e2k1/ath1) TIGR (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) NCBI 10. תמיסות בופר הפקת DNA 10ml DNA Extraction Buffer 10ml Nucleic Lysis Buffer 4ml 5% N-lauryl sarcosine 0.038gr Sodium Bisulfite

48 DNA Extraction Buffer 35mM Sorbitol 100mM Trizma base 4.5mM EDTA ph=7.5 Nuclei Lysis Buffer 200mM Trizma base ph7.5 50mM EDTA 2M NaCl 55mM CTAB GHC Buffer Guanidine HCl 1M NaCitrate, ph7 1M DTT 0.25mMבופר,pH7 פוספט 150mM Na 2 HPO 4 100mM NaH 2 PO 4 LBמצע גידול לחיידקים 1% NaCl 0.5% Bacto-yeast extract 1% Bacto-trypron

49 תרביות רקמה בעגבנייה (כמויות לליטר מצע) מצע הנבטה 4.4 gr MS(N0224) 20 gr Sucrose 10 gr Plant agar ph=5.7 מצע חיתוך פסיגים 4.4 gr MS (N0256) 30 gr Sucrose ph=5.7 מצע מיהול אגרובקטריום 4.4 gr MS (N0256) 30 gr Sucrose ph=5.2 מצע feeder 4.4 gr MS(N0222) 30 gr Sucrose 10 gr Plant agar 2.5 ml 40 mm Acetoseringon 1 mg 2,4-D (in ethanol) ph=5.7 מצע JI 4.4 gr MS(N0256)

50 30 gr Sucrose 2.5 Fitagel 500 mg Carbenicilin 100 mg Kanamicin 2 mg Biotin 1 mg Zeatin ph=5.7 מצע JII 4.4 gr MS (N0256) 30 gr Sucrose 10 gr Plant agar 250 mg Carbenicilin 100 mg Kanamicin 2 mg Biotin 1 mg Zeatin 0.5 mg Zeatin Ribozide 250 mg Cefatoxim ph=5.7 מצע JIII 4.4 gr MS (N0256) 30 gr Sucrose 10 gr Plant agar

51 250 mg Carbenicilin 100 mg Kanamicin 2 mg Biotin 0.2 mg Zeatin 250 mg Cefatoxim ph=5.7 מצע השרשה 4.4gr MS (N0224) 30 gr Sucrose 10 gr Plant agar 150 mg Carbenicilin 50 mg Kanamicin 1 mg IBA ph=5.7 מצע סלקציה להנבטת זרעים 4.4 gr MS (N0224) 20 gr Sucrose 10 gr Plant agar 50 mg Kanamicin ph=5.7 צביעת GUS תמיסה לצביעת GUS 9 ml 1xGUS buffer 0.5 ml 0.1 M k-ferrocyanide

52 0.5 ml 0.1 M k-ferricyanide 10 mg x-glc (in DMSO) 1X GUS buffer 125 mm NaPO4 buffer (ph=7) 1.25% TX-100 12.5 mm EDTA תמיסות לקיבוע בשעווה FAA 3.7% Formaldehyde 50% Ethanol 5% Acetic Acid תמיסות In Situ Hybridization Hybridization solution 100 µl 10x in situ salts 400 µl deionized formamide 200 µl 50% dextrane sulfate 10 µl 100XDenhardts solution 20 µl 50mg/ml trna 10x in situ salts (10ml in DEPC water) 6 ml 5M NaCl

53 1 ml 1M Tric-HCl Ph=6.5 0.78 gr NaH 2 PO 4 :2H 2 O 0.71 gr Na 2 HPO 4 1 ml 0.5M EDTA 100X Denhardts solution 2% BSA 2% Ficoll 2% Polyvinyl Pyrolidone NTE buffer 0.5M NaCl 10mM Tris ph=8 1mM EDTA Boehringer block solution 100mM Tris ph=7.5, 150 mm NaCl BSA buffer 1% BSA 150mM NaCl 100mM Tris ph=7.5 0.3% Triton X-100

54 Substrate solution 100mM NaCl 100mM Tris ph=9.5 תמיסות Whole Mount In Situ Fixative (in PBS) 4% Paraformaldehyde 15% DMSO 0.1% Tween-20 ALP buffer 0.1M Tris-HCl ph=9.5 0.1M NaCl 50mM MgCl2 0.1% Tween-20

ב. 55 מטרות המחקר התפתחות איברי הצמח מושפעת מגורמים חיצוניים ופנימיים, אשר קובעים את ההתאמה של הצמח לתנאי הגידול ויעילות התהליכים הפיסיולוגים המתרחשים באיברים אלה. העלה הוא איבר המשמש לייצור אנרגיה ומבנהו משפיע על יעילות תהליך הפוטוסינתזה, וכן על המבנה והפיזיולוגיה של הצמח. צורת העלה ומורכבותו מושפעת מגורמים גנטיים הפעילים בשלבים שונים של התפתחות העלה, מאיניציאציה של הפרימורדיה משולי המריסטמה הקודקודית של הנצר ועד לשלבי קביעת הצורה המוקדמים והמאוחרים. העלה הוא רחב ומכיל מסלולים שונים שבהם פעילים מארג הגורמים המשפיעים על צורת פקטורי שעתוק וגנים מבניים רבים, המושפעים גם מתנאי הסביבה. NAC domain מעורבותם של גנים ממשפחת בתהליך התפתחות המריסטמה תוארה במינים בעלי עלים פשוטים. הירידה במורכבות עלה העגבנייה, במוטנט,gob מרמזת כי משפחת גנים זו מעורבת גם בתהליך התפתחות העלה. המחקר בעגבנייה, אשר מדגימה מרחב התפתחותי מבחינת רמת מורכבות העלה, מאפשר לחשוף את מעורבותם של גנים אלה בשלבים השונים של התפתחות העלה. GOB בעבודה זו נבחן תפקוד הגן המריסטמטי מעגבנייה, ומעורבותו בהתפתחות המריסטמה ובקביעת צורת האיברים אשר נוצרים ממנה. שאלות המחקר: 1 יטוי GOB במהלך התפתחות הצמח, והגורמים המבקרים את ביטויו. 2. תפקיד GOB בשימור המריסטמה, יצירת האיברים והתפתחות העלה המורכב בעגבנייה. 3. הקונטקסט הגנטי בו פועל GOB במהלך קביעת צורת העלה.

ביט. 56 תוצאות 1 וי GOB במהלך התפתחות הצמח, והגורמים המבקרים את ביטויו.,NAC Domain הדמיון ברצף החלבון של GOB וחלבונים שונים ממשפחת והדמיון בפנוטיפ GOB המוטנטים במינים השונים, הביאו אותנו לבחון מהו דפוס הביטוי של בעגבנייה. בנוסף נבחנו שני גורמים אשר צפויים להשפיע על דגם הביטוי של הפרומוטר ו- mir164. :GOB 1.1. ביטוי GOB בגבולות מקדים התפתחות רקמה בציר חדש על מנת להבין כיצד משפיע GOB על תפקוד המריסטמה, הפרדת איברים והתפתחות העלה GOB המורכב, נבחנה בפירוט תבנית הביטוי של בזמן ובמרחב בעזרת אנליזת In Situ.Hybridization במריסטמה נראה סיגנאל GOB בפס צר של תאים בין המריסטמה לפרימורדיות המתפתחות בשוליה, ברמה גבוהה וממוקדת (תמונה.(3A-B,3D,3F-G בפני המריסטמה, באזור שבו עתידה להתפתח פרימורדיה נראה ביטוי בשלב שבו עדין לא רואים התרחבות פיזית של הפרימורדיה אל מחוץ לפני השטח של המריסטמה (תמונה 3B). בשלב שבו העלה הוא גלילי (לפני התרחבות של עלעלים), GOB מתבטא בפס צר לרוחב העלה, בצד האדקסיאלי משני צידי העורק המרכזי (תמונה.(3D-E במהלך התפתחות העלה יש גדילה של העלעל אל מחוץ למבנה הגלילי של העלה, ובשלב זה GOB מתבטא משני צידי העלעל הצעיר, סביב האזור שממנו מתרחב העלעל GOB החוצה.(3B-C,3E (תמונה בעלעל הטרמינלי נראה ביטוי בעלה המתרחב בין האונות (תמונה.(3K-L בעלה הבוגר לאחר התרחבות העלעלים, מתקבל בעלעל המתפתח דפוס ביטוי של פסים סביב ההיקף פנימה, המרמז על התפתחות עלעלים משניים (תמונה.(3M-N בפרימורדית הפרח ביטוי GOB מתחיל בפס צר ומוגדר במרכז הפרימורדיה (תמונה 3J). עם התפתחות הפרח והיווצרות האיברים בדורים השונים מתקבל סימון בין האיברים בכל הדורים וגם בעלי הגביע (תמונה 3I).

57 הגן 3. תמונה. A-C GOB מתבטא בגבול שבין המריסטמה לאיברים. חתכים עוקבים במריסטמה של צמח. D-E. WT מריסטמה שלמה. F-G. חתך רוחב במריסטמה. H. חתך רוחב דרך צידו התחתון של עלה.. I-J פרח. K-L. עלעל טרמינלי בעלה מפותח. M-N. עלעל בעלה מפותח. M -מריסטמה. P -פרימורדיה הממוספרת לפי סדר היציאה מן המריסטמה. החיצים מסמנים את הסיגנאל בין המריסטמה הקודקודית והפרימורדיה ובפרח בין הדורים. החיצים מסמנים את הסיגנאל בעלים ובעלעלים. ראשי לסיכום הביטוי של, GOB מתמקד בגבול שבין המריסטמה לאיברים הנוצרים בשוליה (עלים בשולי המריסטמה הקודקודית של הנצר ואיברי פרח בשולי מריסטמת הפרח), ובגבול הנוצר ומקדים התפתחות עלעלים בשולי העלה המתפתח.

58. 1.2 pgob מתבטא בשולי המריסטמה ובצינורות ההובלה דגם הביטוי של GOB מושפע מגורמי בקרה, אשר מכווננים את רמת הביטוי באזורים השונים. בעבודה זו נבחנו שני גורמים: הפרומוטר המשפיע על זמן ומיקום שעתוק GOB ו- mir164, אשר ידוע כמבקר גנים ממשפחת.NAC domain סביר להניח כי הפרומוטר מכוון את הביטוי לאזור נרחב ואז פועלים גורמי בקרה נוספים, כגון, mir164 אשר מצמצמים את ביטוי GOB לאזור צר יותר. במינים שבהם נחקרו גנים מריסטמטים ממשפחת,NAC Domain נמצא כי ביטוי הגנים ממוקם באזור בו נראית תוצאת הפעילות שלהם, ולכן גם במקרה של GOB ההנחה היא שהגורם המגדיר את אזורי הפעילות הוא אזור הביטוי של הגן. הדמיון של רצף החלבון GOB ודגם הביטוי שלו בהשוואה לגנים ממשפחת NAC Domain הפעילים במריסטמה הקודקודית של הנצר במינים שונים, מרמזים כי פעולת החלבונים היא pgob דומה. הבחינה של דגם הביטוי המכוון על ידי האם לרמז יכולה ההבדל בצורת העלה הסופית נובעת מאזורי הביטוי של הפרומוטר. במטרה לאפיין את הפרומוטר של הגן GOB שובט pgob.(4 רצף (תמונה pgob מקטע, אשר נמצא במעלה הזרם לגן וסומן הושווה למאגרי המידע ולא הראה דמיון לרצפים ידועים. mir164 Recognition site pgob -2300 1 SL_EcoRI0127N16 1985 תמונה 4. ארגון הגן GOB הפרומוטר ששובט וכיוונו של ומקטע הפרומוטר שרוצף. החץ האדום מסמן את תחילת רצף NAC Domain. GOB ביחס לגן SL_EcoRI0123N16 BAC מסומן ע"י האזור האפור. ריבוע שחור/אפור מלא מסמן איזור מקודד וקו שחור מסמן אינטרון. הריבוע הירוק מסמן את המקטע שנקרא.pGOB

59 GUS שימש להכוונת הביטוי של הגן המדווח pgob במטרה לאפיין את דגם הביטוי המרחבי אותו הוא מכוון. הביטוי המכוון על ידי הפרומוטר נבחן בארבידופסיס ובעגבנייה כדי להשוות בין דגמי הביטוי במינים שונים ולהסיק על הבדלים גנטיים המשפיעים על ביטוי הפרומוטר. בנוסף.pCUC2 ביטוי pgob בארבידופסיס מאפשר להשוות בין הביטוי שלו לביטוי שדווח לגבי בארבידופסיס נבחנו שני קווים שהראו ביטוי דומה עם הבדל בעוצמה. pgob>>gus#1 בארבידופסיס מראה ביטוי בין המריסטמה לעלים ובקצות הפסיגים, בשיניים בכל היקף העלה, ובקצה העורק המרכזי של העלה.(5A-D (תמונה הביטוי בקצה השן הוא חזק וממוקד והולך ונחלש במרחק מהשן. בקו pgob>>gus#6 התקבל ביטוי חזק יותר, הנראה בעלים בנקודות בכל ההיקף במיקום של השיניים וביטוי חזק לאורך העורק המרכזי (תמונה.(5D-E שני הקווים.(5F הראו ביטוי בשורש, סביב הנקודה שבה מתפתח שורש צדדי (תמונה בפרח מתבטא 5G). בחיבור שבין הפרח לתפרחת ובאזור הצלקת (תמונה pgob>>gus בבחינת ביטוי pgob>>gus בעגבנייה התקבל ביטוי ספציפי למריסטמה כאשר משך האינקובציה היתה קצרה, והתרחבות הביטוי לפסיג כאשר האינקובציה היתה ממושכת יותר (תמונה.(5H-I בשלבי התפתחות הצמח המוקדמים ביטוי נראה ממוקד במריסטמה ובעלה.(5K-L הצעיר, ובעלה שמתחיל להתרחב נראה ביטוי באונות בהיקף העלה ובעורקים (תמונה בחתך בנבט צעיר נראה ביטוי נרחב בצידי הגבעול ובגבול שבין המריסטמה והפרימורדיה (תמונה 5J). ביטוי חזק וממוקד התקבל בשורש בנקודת התפתחות שורשים צדדיים ולאורך השורש הצדדי לאחר שהתארך (תמונה.(5P-Q ביטוי ממוקד התקבל בנקודת החיבור של עוקץ התפרחת והעלה לגבעול המרכזי (תמונה 5N). בעלעל הטרמינלי ובעלעלים האינטרקלרים התקבל גראדינט של ביטוי בעורקים, כאשר הביטוי חזק וממוקד לכיוון קצה הטרף וחלש וכללי לכיוון הפטוטרת 5M). (תמונה בשימוש ב- GUS כגן מדווח ישנה אפשרות להתפשטות דיפוזית של הצבע בצינורות ההובלה וקבלת תוצאות שאינן משקפות את דגם הביטוי בצורה מדויקת. התוצאות שהתקבלו הינן ראשוניות ולכן נדרשים ניסויים נוספים במטרה לתאר את דגם הביטוי של GOB>>GUS באופן מדויק יותר.

60 תמונה.5 דפוס הביטוי של pgob>>gus מראה מאפיינים דומים בצמחי ארבידופסיס ועגבנייה. A-G. ארבידופסיס. H-Q. עגבנייה. A-B. נבט לאחר גדילה של שני העלים הראשונים. החיצים מסמנים את האזור שבין הפסיגים למריסטמה ונראית שם צביעה ספציפית. C. עלה שושנת pgob>>gus#1 שהתרחב. D. עלה שושנת. E. pgob>>gus#6 צמח pgob>>gus#6 לאחר המעבר לפריחה. F. אזור ההתפצלות של שורש צדדי. G פרח. H-L. נבט. H. pgob>>gus #3 צביעה ממושכת. I. צביעה קצרה. J. חתך אורך במריסטמה. החץ מסמן את האזור שבין המריסטמה הקודקודית לפרימורדיום. K. מריסטמה ופרימורדיה של עלה ראשון. L. עלה ראשון. החץ מסמן את העלעל המתפתח. M. עלעל טרמינלי בעלה בוגר. N. תפרחת צעירה. החץ מסמן את נקודת החיבור בין התפרחת והעלה לגבעול. O. תפרחת מפותחת. החץ מסמן את נקודת החיבור של הפרח לתפרחת. P. שורש צדדי. Q. שורש ראשי.

61 pgob>>gus הן אם כן, בארבידופסיס והן בעגבנייה מתבטא בגבול שבין המריסטמה לפרימורדיה, בחיבור של העלים לגבעול ובגבול שבין השורש הראשי לשורש הצדדי. בעלה הפרומוטר מתבטא בצורה דומה באזור השיניים אך בצינורות ההובלה מתקבלת הרחבה של הביטוי בעגבנייה בהשוואה לארבידופסיס. ההבדל יכול לנבוע מכך שבהתפתחות עלה מורכב ביטוי הוא ממושך ומשפיע על שלבי התרחבות העלה והתמיינות צינורות ההובלה. אפשר pgob שהביטוי הממושך בעגבנייה דורש שותפים גנטיים החסרים בארבידופסיס או שנדרש חלון התפתחותי ממושך בכדי לראות את השפעת pgob על העלה, וחלון התפתחותי זה הוא קצר pcuc2:gus בארבידופסיס. בספרות מדווח כי מתבטא בסינוסים שבין האונות סביב היקף העלה 2006) al..(nikovics et דגמי הביטוי של הפרומוטרים הם מנוגדים מבחינת מיקום הביטוי באונה, כך ש- pgob מתבטא בשן ו- pcuc2 מתבטא בין השיניים. ההבדל יכול לנבוע מכך שהמקטע ששובט אינו מכיל את כל רצפי הבקרה בעגבנייה, לחליפין, ייתכן כי הפרומוטרים מעגבנייה וארבידופסיס מכוונים ביטוי שונה בעלים, דבר היכול להסביר חלקית את ההבדל בין צורת העלה בשני המינים. mir164 1.3. מבקר את ביטוי GOB בעגבנייה mir164 בארבידופסיס ידוע שחמישה גנים ממשפחת NAC domain מכילים אתר הכרות של המראה רמת קומפלמנטציה גבוהה לרצף של,miR164 ומבוקרים על ידו ) ;2005 al. Laufs et,mir164 הגן GOB מכיל אתר הכרות של שבו יש שתי אי התאמות.(Mallory et al. 2004b,RNA Ligase Mediated-RACE (RLM-RACE) לרצף mir164 מארבידופסיס. ריאקצית.miR164 הראתה כי כצפוי מקיום אתר החיתוך, GOB תעתיקי עוברים חיתוך בהכוונת בריאקצית PCRR התקבלו תוצרים בגודל הצפוי מחיבור של אדפטור לאתר ההכרות של,miR164 תוצאה המעידה כי ישנו תעתיק חתוך של GOB היכול לעבור קישור לאדפטור. בריצוף של 4/5 11 10 מהתוצרים שהתקבלו מצמח WT נראה חיתוך בין בסיס לבסיס באתר ההיכרות של (תמונה התוצאה אישרה שבעגבנייה מבוקר ע"י,miR164 וחיתוך תעתיק GOB.(6 mir164 GOB מתבצע באתר הצפוי.

62 תמונה 6. חיתוך תעתיק הגן GOB מתווך על ידי. mir164 mir164,mir164 כיוון ש- GOB עובר חיתוך ע"י צפוי שבאזור הביטוי של תתקבל ירידה או חוסר ביטוי של. GOB בכדי לזהות את אזור הביטוי של mir164 נערכה אנליזת In Situ mir164.wt על חתכים ומריסטמה שלמה של צמח עם גלאי,LNA-miR164 Hybridization מתבטא סביב כיפת המריסטמה בשכבות העליונות, ובפרימורדית העלה הביטוי הוא נרחב בצד האדקסיאלי (תמונה.(7A-B,7D-E בעלה לאחר התרחבות העלעלים נראה ביטוי ממוקד וחזק בעלעלים וחוסר ביטוי סביב בסיס העלעל (תמונה GOB ). 7C,7F-I מתבטא בגבול שבין,miR164 האיברים והמריסטמה, ובבסיס העלעלים, במספר שורות תאים, לעומת ביטוי שהוא ו- mir164 GOB נרחב בעלים ובמריסטמה. דגמי הביטוי של משלימים, כלומר באזורים בהם מתבטא. GOB כתוצאה מפירוק תעתיק, GOB חסר ביטוי של mir164

63 תמונה mir164 7. מתבטא במרכז המריסטמה, בעלים ובעלעלים.. A-B חתכי אורך במריסטמה.. C מריסטמה שלמה.. D-E חתכי רוחב במריסטמה. F-G. חתך רוחב בצד התחתון של עלה.. H-I עלים מאוחרים.. J הגדלה של אזור העלעלים ב -I M -מריסטמה.. P -פרימורדיה הממוספרת לפי סדר היציאה מן המריסטמה. החיצים מסמנים את הסיגנאל במריסטמה הקודקודית ובפרימורדיה. ראשי החיצים מסמנים את הסיגנאל בעלים ובעלעלים. ביטוי GOB בגבולות שבין המריסטמה לפרימורדיה זהה לביטוי של גנים ממשפחת NAC Domain במינים אחרים שאופיינו. CUC2 מתבטא בשולי העלה בארבידופסיס, ו- GOB מתבטא בבסיס העלעלים בעלה. הדמיון בדפוס הביטוי בעלה מעיד כי יש לגנים אלה קשר ליצירת אונות בעלה פשוט ועלעלים בעלה המורכב, ומרמז כי יש קשר התפתחותי בין אונות ועלעלים המושפע אולי ממשך הזמן שיש ליצירת רמות ניצוי נוספות. pgob מקטע ששובט מכיל אלמנטים המכוונים את הביטוי לאזורי הגבול ואזור השיניים בשולי העלה. דגמי הביטוי אשר התקבלו בעלים בארבידופסיס ועגבנייה מצביעים על הבדל בביטוי בצינורות ההובלה, והבדל זה יכול להיות קשור להתפתחות צורת העלה. הבקרה על ידי mir164 היא שלב חשוב בקביעת אזורי הפעילות של. GOB אזורי הביטוי של pgob ו mir164- חופפים, ונראה כי pgob מכוון את הביטוי הראשוני לכל השן והחיתוך על ידי מנגנון mir164 מנקה את התעתיק באזורי הביטוי של

64 כלומר מרוב השן. בנוסף לרמות בקרה אלה ייתכן כי ביטוי GOB ברמת גם מבוקר,miR164 התרגום וברמת פעילות החלבון באזורים בהם קיים תעתיק שלם.

65 2. תפקיד GOB בשימור המריסטמה, יצירת האיברים והתפתחות העלה המורכב בעגבנייה. התפתחות המריסטמה היא שלב התפתחותי חשוב בקביעת צורת הצמח ומהלך הגדילה שלו. GOB הוא גן המראה השפעה על תפקוד המריסטמה והתפתחות איברי הצמח, כאשר הוא אינו פעיל או פעיל ביתר. בפרק זה נעשה ניסיון להבין את תפקידו של הגן GOB בקביעת צורת העלה על ידי בחינת הפנוטיפים הנובעים מפגיעה בביטויו או ביטויו האקטופי. 2.1. פגיעה בפעילות GOB גורמת לתפקוד לקוי של המריסטמה הקודקודית של הנצר וירידה במורכבות העלה gob הוא מוטנט רצסיבי המראה איחוי של הפסיגים למבנה דמוי גביע, וחסר מריסטמה פעילה ;2007 al. ). Brand et במטרה לבחון לעומק את תפקיד GOB בהתפתחות העלה, (תמונה 8A-B.gob חיתוך הפסיגים מאפשר אופיין המוטנט,gob בשלב שלאחר חיתוך רקמת הפסיגים בנבט רגנרציה והתפתחות של צמח בעל עלים פשוטים יותר בהשוואה לצמח WT (תמונה.(8C-E בצמח הפטוטרת של העלה נפרדת מהגבעול, gob בצמח החלק התחתון של הפטוטרת מאוחה WT gob.(8e לגבעול (חץ בתמונה בצמח קיים שלטון קודקודי חזק ואין התפתחות של מריסטמה בחיק העלה (תמונה 8E) עלה gob יכול להיות פשוט כמעט לגמרי או בעל ניצוי ראשוני בלבד ובו עלעלים בעלי שולים חלקים (תמונה.(8D-E בעלים מבוגרים ניתן לראות עורק מרכזי רחב ושטוח.(8G-I שלאורכו התפתחו עלעלים רבים ועגולים בעלי פטוטרות מאורכות (תמונה הפרח הוא מאורך, עלי הגביע מאוחים חלקית, עלי הכותרת מאוחים לאבקנים, ובפרי קיימות צלקות לאורך החיבור בין עלי השחלה (חיצים בתמונה.(8K-N

66 תמונה 8. המוטנט gob פגוע בהתפתחות המריסטמה הקודקודית של הנצר, בהפרדת איברים ובהתפתחות העלה.. A נבט.B.WT נבט. C.gob נבטי gob לאחר חיתוך הפסיגים. D. עלה. gob עלה. G. החץ מראה את אזור האיחוי של פטוטרת העלה לגבעול. gob צמחי. E-F. WT. H עלה gob מבוגר. I. תקריב על העורק המרכזי בתמונה. J. H פרח. WT עלי הגביע נפרשים לאחור כאשר הפרח נפתח.. K פרח.gob עלי הגביע מכסים את עלי הכותרת המסולסלים. L. עלה כותרת המראה רקמה אקטופית.. M-P פירות gob בשלבי התפתחות שונים. O. החץ מראה את הצלקות על הפרי. דגם הביטוי של הגן GOB מרמז כי הגן פעיל בהגדרת גבול בין איברים. נראה כי חוסר בהגדרת גבול מביא לגדילה של הרקמה ללא הפרדה בין אזורים כפי שנראה בנבט.gob הירידה בניצוי

67, gob מרמזים כי ל- GOB השפעה על עומק האוניות בעלעל ועל קביעת המיקום של יצירת עלעלי משנה. המוטנט gob הוא רצסיבי וההנחה היתה שהפנוטיפ של המוטנט נגרם מירידה בביטוי הגן. כצפוי בריאקצית RT-PCR נמצא כי ביטוי GOB יורד פי 14 במוטנט gob בהשוואה לביטוי ב - WT (תמונה.( 9 תמונה. 9 במוטנט gob ישנה ירידה בביטוי הגן.GOB כימות רמת הביטוי נעשה בשיטת RT- PCR על RNA שהופק מהאזור שבין הפסיגים בנבטי WT ו gob-. הערכים מוצגים כיחס בין ביטוי GOB לביטוי הגן ACTIN שביטויו קבוע במהלך ההתפתחות. ירידה בביטוי GOB בכל אזורי הביטוי שלו מביאה לפנוטיפ חמור של איחוי פסיגים, וכצפוי ביטוי.( Alvarez et al. 2006) gob חיקה חלק מהפנוטיפים של המוטנט 35S בעזרת פרומוטר mir164 ציפינו כי ביטוי mir164 בתבנית הביטוי של GOB יחקה גם הוא את פנוטיפ, gob או שיגרום לפנוטיפ חמור יותר בשל פגיעה בגני מטרה נוספים של.miR164 חלק מהנבטים שביטאו את mir164 בעזרת פרומוטר.(pGOB>>miR164) pgob היו בעלי פסיגים שבורים שנשארו בתוך

68 נבטים אחרים פיתחו פסיגים נורמאליים (תמונה אך משני צידי המריסטמה התפתחו עלים.(10A-C גליליים בפילוטקסיס פגום ). 10D (תמונה פעם יחידה התפתח נבט שנראה נורמאלי בשלב הפסיגים אך לאחר מכן התפתח עלה ראשון בעל עורק מרכזי שטוח והעלה הבא התפתח באזור האיחוי 10E). מצמח זה נאספו זרעים, (תמונה והפנוטיפ של הפגמים המוקדמים חזר בצאצאי mir164 הצמח. נראה אם כן, כי גנים נוספים המבוקרים על ידי פועלים גם הם במריסטמה הקודקודית של הנצר, ופגיעה בפעילותם מחמירה את פנוטיפ.gob תמונה. 10 נבטי pgob>>mir164 מראים פגמים בשלבים מוקדמים בהתפתחות המריסטמה הקודקודית של הנצר.. A-D נבט. B. pgob>>mir164 תקריב על קצהו העליון של הנבט ב - A. E נבט pgob>>mir164 בוגר. המריסטמה שהתפתחה על הפטוטרת השטוחה מסומנת בחץ.

69 פנוטיפ המוטנט gob הינו חמור ומייצג ירידה בביטוי בכל האזורים בהם מתבטא GOB באופן טבעי בצמח, ואפשר שהפגיעה במריסטמה העוברית גורמת פגיעה משנית בהתפתחות העלים. כדי mir164 לבחון באופן ספציפי את תפקיד GOB ויתר בני המשפחה המבוקרים על ידי בעלה,, pfil המתבטא בפרימורדיה של העלים והאיברים הצדדיים. בוטא mir164 בעזרת הפרומוטר בצמח pfil>>mir164 המריסטמה הקודקודית של הנצר מתפתחת בצורה נורמאלית ואין שינוי במספר העלעלים הראשוניים. השינויים מתבטאים בכך שהעלים בעלי רמת ניצוי ראשונית.(11A-C העלים מראים בלבד, שולי העלעלים חסרי אונות וישנה ירידה בניצוי המשני (תמונה דמיון לעלים של מוטנט gob המתאושש. עלי הגביע הם מאורכים ומאוחים לאורכם, ובשלב פתיחת הפרח עלי הגביע נשארים מאוחים בקבוצות (תמונה.(11D-F הפרי הוא מאורך ויש ירידה במספר הזרעים הנוצרים בפרי (תמונה 26M). בהתאמה לדמיון הפנוטיפי נמצא כי ביטוי הגן GOB יורד בצמח, pfil>>mir164 אך לא לרמה הנמוכה שנראית במוטנט gob (תוצאה לא מוצגת). תמונה 11. עיכוב ממוקד של ביטוי GOB בפרימורדיה מביאה לירידה במורכבות העלה בצמח. A. pfil>>mir164 עלה. B. WT עלה. C. pfil>>mir164 צמח WT וצמח

70.F WT.E.pFIL>>miR164 שמאל-פרח,WT ימין- פרח פרח בוגר..D.pFIL>>miR164 פרח pfil>>mir164 בוגר.,In Situ Hybridization הביטוי של,GOB כפי שנראה באנליזת מתמקד בגבול שבין המריסטמה לפרימורדית העלה המתפתחת בשוליה, ותוצאה זו נמצאת בהתאמה לפנוטיפ איחוי הפסיגים אשר מתקבל במוטנט gob ולדגם הביטוי שהתקבל על ידי.pGOB הביטוי בפסים סביב העלעל המתפתח מהווה תמונת ראי לביטוי mir164 ומחזק את ההשערה כי mir164 מנקה את תעתיק הגן GOB מהאזורים בהם יש חפיפה בשעתוק של הגנים. דגם הביטוי של GOB ופנוטיפ המוטנט gob מצביעים על כך שחוסר בקביעה ברורה של גבול בשלבים המוקדמים של התפתחות המריסטמה הקודקודית של הנצר, מביא לגדילת רקמת הפסיגים בצורה מאוחה ללא הפרדה. נראה כי סימון העלעלים ועלעלי המשנה הכרחית ליצירת אונות והתפתחות של ניצוי משני, כיוון GOB שבהם יש ירידה בביטוי,pFIL>>miR164 שבמוטנט gob או בצמח מתקבל עלה פשוט יותר עם שוליים חלקים. 2.2. העלייה בביטוי GOB במוטנט Gob-4d נובעת מפגיעה בבקרה על ידי,miR164 ומביאה לשינויים פנוטיפים נרחבים האללים הרצסיביים gob1-3 מייצגים מוטנט מסוג (LOF),Loss Of Function המייצג חוסר או ירידה בתפקוד.GOB דרך נוספת להבנת פעילותו של גן וחשיבות הבקרה עליו היא אפיון מוטציות מסוג (GOF),Gain Of Function שבהן ישנה פגיעה בבקרה על הגן. פנוטיפים הנגרמים מביטוי הגן שלא במקום הטבעי יכולים לרמז על תפקיד הגן, ולכן אפיינו מוטנט מסוג,GOF שבו יש פגיעה בבקרה על ביטוי.GOB האלל Gob-4d נמצא בסריקה של אוכלוסיית מוטנטים רחבה, שיוצרה על ידי.(Menda et al. 2004 ) EMS בכדי לזהות האם המוטנט הוא אלל של GOB או פגוע בגן המבקר את,GOB רוצף הגן GOB במוטנט. בריצוף הגן GOB במוטנט Gob-4d נמצאה החלפת בסיס יחידה בגן,GOB הממוקמת באתר ההיכרות של.miR164 זיהוי המוטציה במוטנט Gob-4d העלתה את הסברה כי הפנוטיפ הדרמטי של המוטנט נובע מירידה ברמת החיתוך של

י" 71 Gob-4d- שבודד מ RNA על RLM-RACE לכן בוצעה ריאקצית, ע mir164 GOB הטרוזיגוט והומוזיגוט. בתוצרי הריאקציה שהתקבלו מההטרוזיגוט מקור התוצרים שעברו.Gob-4d חיתוך היה מהאלל הנורמאלי ולא זוהו תוצרי חיתוך שמקורם באלל המוטנט בהומוזיגוט, התקבלו רק תוצרים קצרים אשר הסתיימו לפני אתר ההכרות של mir164 Gob-4d וההנחה היא שאין חיתוך של תעתיקי הגן אשר נושאים את המוטציה או שרמת התוצרים mir164 המוטנטים שנחתכים היא נמוכה מאוד. תוצאות אלו אישרו כי יש פגיעה בבקרה ע"י המביאה כנראה לירידה בחיתוך תעתיקי GOB במוטנט. Gob-4d האלל Gob-4d הוא דומיננטי וההנחה היא שבמוטנט ישנה עלייה בביטוי. GOB ואמנם בבחינת 1.24 רמת הביטוי של הגן GOB במוטנט, Gob-4d נמצא כי בהטרוזיגוט יש עלייה בביטוי פי ובהומוזיגוט פי 1.54 בהשוואה ל- WT (תמונה ). 12 תמונה 12. עלייה בביטוי הגן GOB באלל. Gob-4d כימות רמת הביטוי נעשה בשיטת RT- PCR על RNA שהופק מהאזור שבין הפסיגים בנבטי Gob-4d, WT הטרוזיגוט והומוזיגוט. הערכים מוצגים כיחס בין ביטוי GOB לביטוי הגן ACTIN שביטויו קבוע במהלך ההתפתחות.

72 העלייה בביטוי GOB יכולה להתפרש כעליה בביטוי באותם תאים או התפשטות הביטוי לתאים חדשים. באנליזת In Situ Hybridization נמצא כי ביטוי GOB במוטנט Gob-4d עולה ומתרחב לשורות תאים נוספות לכיוון המריסטמה ולכיוון הפרימורדיום (תמונה.(13A-G בעלה שהתרחב.(13E-H הביטוי מתפשט לתוך העלעל המתפתח, ולשולי העלעל (תמונה התוצאות מעידות כי GOB פנוטיפ המוטנט Gob-4d נובע מהתרחבות אזור הביטוי של לתאים שבהם בדרך כלל יש חיתוך תעתיק GOB ע י". mir164 תמונה 13. באלל. A-B,E-G. GOB נראית עלייה והרחבה של האזור המבטא את Gob-4d חתכי אורך במריסטמה של. C-D,H. Gob-4d חתך רוחב במריסטמה של הומוזיגוט. Gob-4d. B,D מריסטמה מפוצלת. M -מריסטמה. P -פרימורדיה הממוספרת לפי סדר היציאה מן המריסטמה. החיצים מסמנים את הסיגנאל בין המריסטמה הקודקודית והפרימורדיה ובפרח בין הדורים. ראשי החיצים מסמנים את הסיגנאל בעלים ובעלעלים. מראה פנוטיפ דומיננטי הבא לידי ביטוי בכל שלבי ההתפתחות. בהומוזיגוט המוטנט Gob-4d הפנוטיפים קיצוניים יותר אך גם בהטרוזיגוט הם ברורים ובולטים. בנבט עגבנייה נורמאלי 3-4 Gob-4d מתפתחים שני פסיגים, לעומת זאת בנבט מתפתחים פסיגים, שלפעמים הם בעלי פטוטרות נפרדות ולפעמים יש פטוטרת משותפת ואז יש התפצלות לשני טרפים נפרדים (תמונה

73.(14A-B בשלבים מוקדמים של יצירת עלים המריסטמה מתפצלת, ופיצול זה מביא ליצירת נוף שיחי ודחוס (תמונה.(14C-H במריסטמה יש פגיעה בפילוטקסיס והפרימורדיה אינן מרוחקות זו מזו בזווית קבועה. בשלבים המוקדמים של ההתפתחות בצמח,WT העלעלים מופרדים מהעלה ויוצרים זווית קהה ויש מרווח גדול ביניהם לאורך העלה. בעלה Gob-4d העלעלים קרובים יותר ויוצרים זווית חדה ביניהם לבין העלה. כבר בשלבים הראשונים של התפתחות העלה נראה איחוי בין העלעלים הצמודים אל העלעל הטרמינאלי. בשלב התרחבות הטרף עלעלים אלה מתחברים אל העלעל הטרמינאלי, וחיבור זה מביא לקבלת עלעל טרמינאלי מאורך, בעל אונות עמוקות. בעקבות זאת נראית ירידה במספר העלעלים הראשוניים. קיצור הפטוטרות בעלעלים, מביא לכך שהטרף של העלעל קרוב לעורק המרכזי (תמונה.(14I-K בשלבים מאוחרים של התפתחות העלה מופיעות על העורק המרכזי פרימורדיות של עלים, אשר בד"כ נשארים קטנים וגליליים, אך לפעמים יש יצירה של עלים דמויי לוטוס (תמונה 14L). הצמח ההומוזיגוט מייצר מעט פרחים שבהם נוצרים יותר אבקנים, שאינם מאוחים לצינור (תמונה.(14M-N במצב ההטרוזיגוטי נראית רמה גבוהה של פרתנוקרפיות ומיוצרים מעט זרעים. רמת הפרתנוקרפיה מחמירה בתנאי שדה ואז גם מתפתחים עלי שחלה אקטופיים בתוך הפרי (תמונה.(14O-R

74 תמונה 14. האלל Gob-4d מראה שינויים פנוטיפיים נרחבים. אם לא צוין אחרת בצד השמאלי נראה צמח WT ובצד הימני צמח Gob-4d הומוזיגוט. A-B. נבט. C-D. צמח שלם. E-F. תקריב על הגבעול.. G-H מריסטמה קודקודית.. I עלה. J. WT עלה Gob-4d הטרוזיגוט. K. עלה Gob-4d הומוזיגוט. L. תקריב על גבעול מרכזי בעלה Gob-4d הומוזיגוט. M. האבקנים בפרח Gob-4d הומוזיגוט.. N האבקנים בפרח. O-P. WT פרי שלם. Q-R. חתך בפרי. בשלב הנבט איחוי הפסיגים ב- gob מהווה ניגוד לריבוי הפסיגים והתפצלות המריסטמה הקודקודית של הנצר ב- Gob-4d. כך גם השוליים החלקים ב- gob המנוגדים להעמקת האונות ב -.Gob-4d לעומת זאת בחינה של רמת ניצוי העלה באללים אלה מעלה כי הפנוטיפים דומים ובשני

75 המוטציה באתר הבקרה של,miR164 אשר מבטלת את הבקרה על רמת תעתיק GOB בצמח, גורמת לעלייה בביטוי ושינוי בדגם הביטוי של GOB באלל.Gob-4d הביטוי המוגבר והתרחבות הביטוי מביא להגדלת אזור הגבול בין המריסטמה לפרימורדיה ויצירת גבולות אקטופים. גבולות אקטופים אלה מביאים להתפצלות המריסטמה ויצירת נוף שיחי והתפתחות של איברים מרובים בפרח. בעלה נראות שתי מגמות: האונות מעמיקות אך במקביל יש ירידה במספר העלעלים וקיצור פטוטרות העלעלים. 2.3. ביטוי אקטופי של GOB משפיע על התרחבות הטרף ועל צורת העלה GOB הפנוטיפ של האללים gob ו- Gob-4d מרמז כי ביטוי באזורי גבול חשוב להפרדת איברים וכי הבקרה על ידי mir164 מאפשרת הגדרה של אזור הפעילות הספציפי. עיכוב ספציפי של GOB ובני משפחה אחרים בפרימורדיה הביא לשולי עלה חלקים בצמח.pFIL>>miR164,GOB במטרה לאפיין את תפקידו של GOB בתהליך יצירת העלים בוטאו צורות שונות של הגן המכילות את הרצף הטבעי או רצפים המכילים מוטציות באתר ההיכרות של mir164 (תמונה 15). ההנחה היא כי הרצף הטבעי יעבור חיתוך באזורים בו הביטוי שלו יחפוף עם ביטוי mir164 ואז ההשפעה שתתקבל תהיה חלשה. לכן הוכנו גם שתי צורות המכילות שינוי אחד או מספר רב mir164 של שינויים ברצף, אשר פוגעים בבקרה על ידי ומגבירות את רמת הביטוי של הגן ברקמת המטרה.

76 תמונה 15. רצפי הגן GOB בצמחים הטרנסגנים. השינויים שהוכנסו ברצף הטרנסגנים מסומנים בקו תחתון. ברצף mir164 מסומנת חוסר ההתאמה הקיים בינו ובין הגן GOB באופן נורמאלי.. 2.3.1 צמח עגבנייה מזן M82 מסיים sp-) ( מפתח עלים ברמת מורכבות עולה נבט העגבנייה הנורמאלי הוא בעל שני פסיגים מאורכים. העלים הראשונים הם פשוטים ובהמשך העלים הם בעלי מורכבות עולה. משלב התפתחות העלה השלישי והלאה העלה מורכב מעלעל טרמינלי ו- 3-4 זוגות עלעלים צדדיים, שבהם הטרף הוא בעל אונות. בעלים מאוחרים ישנם עלעלים על העורק המרכזי, בין הפטוטרות של העלעלים, הנקראים עלעלים אינטרקלארים.. 2.3.2 ביטוי אקטופי של GOB המכוון על ידי פרומוטר 35S גורם עיכוב בהתפתחות הצמח פרומוטר ( p35s) 35S CaMV שימש לביטוי נרחב בכל שלבי התפתחות הצמח, ואיפשר לבחון את p35s>>gob wt ההשפעה שיש לביטוי גבוה ונרחב במתחמים וזמנים חדשים. הפסיגים בנבט רחבים ובעלי שינון בקצותיהם, בעלים יש פחות עלעלים והאונות בשולי העלעלים שטחיות יותר Gob-4d (תמונה.( 16A-C העלים הראשונים מראים דמיון לאלל שבו יש פטוטרות קצרות בעלעלים והעלעלים מרוכזים בחלקו העליון של העלה. צורת הצימוח מראה פגיעה בפילוטקסיס, ובעלים מאוחרים הטרף מתקפל בחלק התחתון ואיזור החיבור בין הטרף לפטוטרת הוא רחב.(16D ושטוח (חץ בתמונה הפרחים גדולים ולפעמים מתפתחים איברים נוספים בדור הראשון והשני.(16E-F (תמונה הפירות פרתנוקרפיים אך נוצרים באופן טבעי (אינם דורשים האבקה ידנית).

77 35S mir164 ביטוי GOB המכיל מוטציה יחידה באתר הבקרה של בעזרת פרומוטר גורם עיוותים התפתחותיים ניכרים. נבט p35s>>gob 4d פורץ את קליפות הזרע באופן נורמאלי ויש ריבוי של מבנים דמויי פסיגים.(16G-H (תמונה בהמשך ההתפתחות בנבטים עם פנוטיפ פחות חמור יש פרישה והתרחבות חלקית של הפסיגים, אך השורש נשאר מעובה וקצר עם מיעוט שורשים משניים. על גבי הפסיגים גדלים גושי תאים אשר דומים להתפתחות קאלוס בתרבית (תמונה.(I-16J באנליזת SEM נראים האזורים דמויי הקאלוסים כשדה של מריסטמות שאינן מאורגנות מבחינת הפילוטקסיס ומיקומן היחסי והעלים המתפתחים לעיתים רחוקות הם בעלי שוליים משוננים.(16K-L (תמונה לעיתים יש התפתחות והתרחבות של עלים ויצירת עלים עגולים בקצה פטוטרת שהתארכה מעל לשדה המריסטמות. הפנוטיפ שהתקבל מחזק את GOB המסקנה של GOB תפקיד בשמירה על מצב מריסטמטי, כך שביטוי נרחב של אשר אינו מבוקר מביא לעצירת שלבים מאוחרים של התרחבות והתמיינות הרקמה. שימור המצב p35s>>gob m המריסטמטי בצמחי p35s>>gob 4d נראה קיצוני, ולמרות זאת נבטי הראו פנוטיפ בעל מאפיינים שונים וחדשים. נבטי p35s>>gob m הם מעוכבים, בעלי היפוקוטיל קצר ורחב ועלים מסולסלים וקטנים (תמונה.(16L-N בכל המקרים התפתחו מזרע יחיד שני נבטים לעיתים אשר הראו איחוי בבסיסם ויצירת שני נצרים נפרדים או שני נבטים נפרדים לחלוטין (תמונה.(16L-N העלים שהתפתחו הם בעלי פטוטרת רחבה ושטוחה שממנה התפתח טרף ירוק ומשונן (תמונה 16N).

78 תמונה 16. ביטוי GOB בעזרת פרומוטר 35S גורם עיכוב בהתפתחות הצמח. A. נבט p35s>>gob wt צעיר. B. נבט. C. p35s>>gob wt עלים של.D. p35s>>gob. wt צמח. p35s>>gob. החץ מסמן את הקצה התחתון של הטרף.. E פרח. F. p35s>>gob. wt עלי wt. I. p35s>>gob 4d נבט. H. צעיר p35s>>gob 4d נבט. G p35s>>gob. גביע של פרח wt נבט. J. p35s>>gob 4d תקריב SEM על אזור המריסטמות ב I-. K. תקריב SEM על אזור המריסטמות ב- H. L-N. נבטי. N. p35s>>gob m החץ מסמן את אזור האיחוי בין העלה לגבעול בנבט. p35s לסיכום, ביטוי בעזרת פרומוטר מייצר פנוטיפים חמורים בכל שלבי ההתפתחות. GOB הכנסת מוטציות ברצף ההכרה mir164 של פוגעת כנראה בבקרה הנורמאלית ומתקבל שיבוש GOB 4d ביצירת איברים והתרחבותם. הסבר אפשרי להבדלים בין ביטוי הגן בצורת לצורת,GOB m הוא שיש חיתוך מסוים של תעתיק הנושא מוטציה אחת וחיתוך זה מופסק לגמרי כאשר יש עוד מוטציות ברצף.

79 2.3.3. ביטוי אקטופי של GOB בפרימורדיה גורם לשינוי בצורת העלה והעלעלים הביטוי הנרחב בעזרת פרומוטר 35S הביא לעיכוב גדילה. בכדי לראות איך ישפיע ביטוי אקטופי GOB של GOB בעלים בלבד על צורת העלה הסופית, השתמשנו בפרומוטר.pFIL צפוי שביטוי בפרימורדיה בלבד, יאפשר איניציאציה תקינה של איברים, כך שניתן יהיה לראות את ההשפעה הספציפית שיש לביטוי GOB בעלה. ביטוי pfil ו- mir164 חופף בעלים הצעירים, ולכן ברוב האזורים שבהם נבטא אקטופית את.miR164 GOB בעזרת הפרומוטר,pFIL תעתיק צפוי להיחתך על ידי בצמח כצפוי GOB pfil>>gob wt נראית השפעה חלשה יחסית של הטרנסגן, והצמח מראה פילוטקסיס נורמאלי..(17B,I הפסיגים מאונים והעלעלים בעלי שולים עגולים (תמונה בעלים אין השפעה על רמת הניצוי, אך העלעלים רחבים יותר עם אונות פחות עמוקות. בעלי הגביע ועלי הכותרת מתפתחות אונות ולפעמים ישנו איחוי של מספר עלי גביע (תמונה.(18A-E בפרח GOB מתבטא בגבולות בין pfil הדורים,(3I-J (תמונה וביטוי אקטופי שלו באיברים בעזרת פרומוטר מרחיב את כנראה.miR164 הרחבת הביטוי מביאה ליצירת גבולות חדשים ביטוי GOB לאזור שבו אין ביטוי של שמביאים לייצור של אונות או רקמה אקטופית באיברים. mir164 ביטוי GOB באזור הפרי מורדיה, אך בתוספת מוטציה המפחיתה את הבקרה על ידי צפוי לחשוף את השפעת התרחבות הביטוי של GOB לעלה. צמח pfil>>gob 4d מראה שינויים פנוטיפים נרחבים. בשלבי ההתפתחות המוקדמים הצמח מעוכב ובחלק התחתון של הצמח מתפתחים עלים אשר מקיפים את הגבעול בפילוטקסיס לא תקין 17E). העלים קטנים (תמונה ומראים ירידה בניצוי הראשוני וחסרי ניצוי משני, והטרף אינו מתרחב אלא נשאר עבה בהשוואה לעלה WT שבו הטרף מתרחב ודק (תמונה,17H). 17J ביטוי pfil>>gob 4d משפיע על דפוס העורקים המתפתחים בעלה ובחלק מן העלים לא נוצרת פטוטרת נפרדת אלא יש התרחבות של הטרף ישירות על העורק המרכזי,17P). 17S (תמונה הגנוטיפ שאליו הוחדר הטרנסגן מראה GOB צימוח מסיים (D M82), ביטוי בעלים ללא בקרה הביא לצורת צימוח בלתי מסיימת (תמונה.(17N-O בפרח מתקבלת החמרה של הפנוטיפים שהתקבלו ב-,pFIL>>GOB wt אשר מתבטאת בהתפתחות של שחלה אקטופית, הקטנה של עלי הכותרת וחוסר איחוי של עלי השחלה במקרים הקיצוניים (תמונה.(19A-E עלי הגביע מפוצלים בקצוות והם קצרים ורחבים, ולפעמים

80 19H-I, 19K). בעלי הגביע השוליים מסולסלים ובעלי אונות ולפעמים ישנם עלי כותרת אקטופיים וקטנים, המתפתחים בין עלי הכותרת הגדולים (תמונה.(19B-F צינור האבקנים מאוחה בקצה אך לפעמים ישנם פתחים באזור בסיס צינור האבקנים, וקצה האבקנים מסולסל ואינו מאוחה (תמונה.(19F-G השחלה קטנה והעלי קצר ומעובה והפירות שהתפתחו על צמחים אלו היו פרתנוקרפיים, אך עם התקדמות הכלאות הניקוי התפתחו לפעמים זרעים חיוניים (תמונה.(19A,19J-K פנוטיפ הצמח מרמז שהבקרה על ביטוי GOB היא חשובה להתפתחות נורמאלית של העלה והתרחבותו, וכי GOB מעכב את שלב התרחבות הרקמה בעלה, כך שביטוי ביתר גורם לעיכוב התרחבות זו. ההחמרה בפנוטיפ הפרח בהשוואה ל- pfil>>gob wt מרמזת על עליה בביטוי,GOB וירידה בבקרה של mir164 בגבולות שבין איברי הפרח, המביאים ליצירת יותר איברים. הוספת מוטציות באזור הבקרה נעשתה בכדי לראות האם בעלה תהיה החמרה נוספת בתהליך התרחבות הטרף. בנבט,pFIL>>GOB m בקצה ההיפוקוטיל מתפתחים עלים קטנים ומעוכבים, ללא סדר או פילוטקסיס ברור, והעלים בעלי מרקם גס ועבה בעלי פטוטרת שטוחה (תמונה.(17D,17F-G שלושה קווים בלתי תלויים הוכלאו ל- pfil והתקבלו פנוטיפים דומים אך בעלי #6 #8 רמת חומרה שונה-קו #3 פחות חמור, קו בעל חומרה בינונית וקו החמור ביותר (תמונה בקווים החלשים ישנו שינוי בגודל העלעלים והפיזור שלהם לאורך המרכזי (תמונה.(17K-M.(17K-L בקו החמור ישנה פגיעה בהתרחבות הטרף וירידה במספר העלעלים (תמונה 17M). בכל הקווים נראית החמרה בעלים המוקדמים. נראה כי מיקום המחדר משפיע על חומרת הפנוטיפ, כך שמתקבל גראדינט פנוטיפים וישנה חפיפה חלקית בין הקו החלש של pfil>>gob m דומה לקו החמור של.pFIL>>GOB 4d

81

R 82 תמונה 17. ביטוי GOB בעזרת הפרומוטר pfil גורם שינויים ניכרים בצורת העלה. A. נבט. D. pfil>>gob 4d נבט. C. pfil>>gob wt נבט. B הפסיגים בעלי שוליים חלקים.. WT נבט.pFIL>>GOB m הנבט מעוכב מאוד והעלים נוצרים לאחר התאוששות של האזור בקצה ההיפוקוטיל.. E צמח pfil>>gob 4d צעיר (ימין) בהשוואה לצמח WT באותו גיל. F. צמח pfil>>gob m צעיר. G. צמח pfil>>gob m צעיר. H. עלים מספר 1,3,5 של. I. WT עלים מספר 1,3,5 של. J. pfil>>gob wt עלים מספר 1,3,5 של. K-M. pfil>>gob 4d עלים. O צמח. N צמח WT בוגר. מספר 1,3,5 של pfil>>gob m בשלושה קווים בלתי תלויים. pfil>>gob 4d בוגר. P,S. עלים שנשטף מהם הכלורופיל ע"מ לחשוף את דפוס פיזור העורקים ויציאת העלעל מן העורק המרכזי.. P עלה. S. pfil>>gob 4d עלה. WT הפטוטרת מתפתחת מהעורק המרכזי ובקצה מתרחב הטרף.. Q עלה 3 של. R. pfil>>gob wt עלה מספר 3 של WT ושלושת קווי.pFIL>>GOB m תמונה 18. בפרח pfil>>gob wt יש ריבוי איברים בפרח. A. פרחים בשלב מוקדם. B. עלי כותרת.. C עלי גביע..D-E תפרחת.

83 תמונה 19. בצמח pfil>>gob 4d ישנה השפעה ניכרת בשלב הרפרודוקטיבי.. A שחלה לאחר אנתזיס.. B תפרחת.. C תקריב על כלי הכותרת. D. עלי כותרת בפרח צעיר. E. פרח. F. פרח צעיר.. G צינור האבקנים.. H עלי גביע. I. עלי גביע. J. פרי..K תפרחת לאחר הבשלת הפירות. לסיכום, ביטוי GOB בעזרת פרומוטר pfil מביא לשינוי בצורת העלה והתרחבות רקמת העלה, וחומרת השינוי נמצאת בקשר ישיר למספר השינויים ברצף ההכרה של.miR164 השינויים בפנוטיפ נובעים מהביטוי האקטופי בפרימורדיה וניתן לשער כי בעלה צריך איזון בין עצירת גדילה להתרחבות הרקמה, אשר מביא ליצירת טרף שטוח בעל אונות בצמח נורמאלי. הביטוי ביתר של GOB מוציא את המערכת מאיזון, גורם עצירת גדילה באזורים נרחבים יותר, וגורר השפעות על גני המטרה של.GOB השפעה משנית יכולה להיות על הגנים הקשורים לתהליך התרחבות הטרף, ואז חלון התפתחות העלה נסגר ואין זמן לסיים את כל שלבי ההתפתחות הנורמאלים. הפנוטיפים המתקבלים בפרח מעידים כי שימור הגבול בין הדורים מביא לייצור של מספר קבוע של איברים והתרחבות הביטוי בגבול או לתוך איברי הפרח מביא לגבולות חדשים שבעקבותיהם נוצרים GOB משפיעה באופן דומה על הטרף איברים נוספים או רקמה אקטופית. הירידה בבקרה על

84 pgob צמחים המבטאים GOB בעזרת פרומוטר מראים השפעה מועטה על צורת.2.3.4 העלה הצביעה שהראה pgob>>gus באזורי גבול, חיזקה את ההשערה שהרצף מספיק בכדי לכל הפחות לחקות את אזורי הביטוי של GOB בצמח נורמאלי. אם אכן זהו המקרה צפוי היה שביטוי,GOB 4d רצף GOB wt יראה פנוטיפ כמעט נורמאלי וביטוי המכיל מוטציה באתר הבקרה של,miR164 בעזרת פרומוטר.Gob-4d יחקה את הפנוטיפ של המוטנט pgob צמחי pgob>>gob wt נראו בד"כ נורמאלים, אך לפעמים נראו נבטים עם יותר משני פסיגים, ובעלים יש ירידה במורכבות מבחינת ניצוי משני ויש פחות עלעלים אינטרקלארים בהשוואה לעלי pgob>>gob 4d (תמונה.(20A-D בצמחי הנבטים היו מעוכבים והראו שינויים WT בפילוטקסיס, והתפצלות של המריסטמה בשכיחות גבוהה (תמונה.(20E-F כל הצמחים שהראו שוני בשלב הנבט התפתחו לצמחים שנראו נורמאלים מבחינת צורת הצימוח ורמת הניצוי של העלה, אך העלים היו בעלי עלעלים עגולים יותר. בעלים הראשונים הפיזור של העלעלים לאורך העורק המרכזי אינו סימטרי, הפטוטרת מאורכת והעלעל הטרמינאלי הוא קטן ביחס לשני העלעלים שצמודים אליו (תמונה 20H). בעלים המאוחרים יש השפעה על צורתו וגודלו של העלעל הטרמינלי וצורת ההתפצלות שלו מהעורק המרכזי (תמונה.(20H-I פרט להתפצלות המריסטמה בשלב מוקדם והפטוטרת המאורכת לא נראה דמיון בין צמח pgob>>gob 4d לאלל,Gob-4d ועובדה זו מרמזת כי הפרומוטר ששובט אינו מחקה במלואו את תפקודו של הפרומוטר האנדוגני מבחינת אזור הביטוי או רמתו. להוספת מוטציות באתר mir164 היתה השפעה ניכרת ובצמחי pgob>>gob m הנבטים הראו עיכוב בהתפתחות שהתבטא ביצירת איזור מתרחב וכדורי בקצה ההיפוקוטיל, שממנו התפתחו עלים בודדים (תמונה.(20J-L העלים הראשונים שהתפתחו הם פשוטים יותר וחסרי פטוטרות ועלה מספר שלוש הוא בעל עורק מרכזי רחב המתפצל לשני עלים או עלעלים ללא ארגון של עלעל טרמינלי 20K). (תמונה הצמח הבוגר התפתח בצורה נורמאלית מבחינת צורת הצימוח וצורת העלים. במעבר לפריחה נראו שינויים פנוטיפיים בפרחים

85,pGOB>>GOB m אשר מראים התארכות שונה של עלי הגביע, הגורמת לחשיפה של.(21A-B עלי הכותרת והאבקנים (תמונה עלי הכותרת מסולסלים ומקופלים ויש שערות אקטופיות בקצה העליון של עלי הכותרת (תמונה,21C). 21F עמוד העלי מראה איזור של חוסר איחוי לכל אורכו ובצלקת ישנם גידולים אקטופים (תמונה.(21D-E תמונה 20. הצמחים המבטאים את GOB בעזרת פרומוטר pgob מראים שינויים פנוטיפים בשלבים הראשונים של התפתחות הצמח.. A צמח pgob>>gob wt צעיר. B. פסיגים ועלים 1,3 של. C. pgob>>gob wt עלה 5 של.D. pgob>>gob wt עלה 3 של. pgob>>gob wt. E-F צמח pgob>>gob 4d צעיר. G. פסיגים ועלים 1,3 של.H. pgob>>gob 4d עלה 5 של.I. pgob>>gob 4d עלה 3 של. J. pgob>>gob 4d נבט.K-L. pgob>>gob m צמח. pgob>>gob m פסיגים ועלים 1,2,3 של. M. צעיר pgob>>gob m

86 תמונה 21. פנוטיפ השלב הרפרודוקטיבי בצמח הטרנסגני A..pGOB>>GOB m פרח צעיר. עלי הגביע מתארכים ברמה שונה ואז נחשפים אבקנים ועלי הכותרת. B. פרח לאחר הורדת עלי הגביע.. C פרח.. D שחלה. E. תקריב על הצלקת..F עלה כותרת. pgob לסיכום, ביטוי של בעזרת פרומוטר הביא לשינויים פנוטיפים בהתפתחות הנבט GOB והעלים הראשונים, כאשר השינוי מתאים ברמתו למספר השינויים שנעשו ברצף ההכרה של.miR164 העלים המוקדמים בעלי ניצוי ראשוני בלבד ופטוטרת מאורכת, והטרף הרחב של העלעל הטרמינאלי יכול להיות תוצאה של איחוי בין העלעלים המשניים לעלעל הטרמינאלי, כפי שנראה באלל.Gob-4d בשלבים מאוחרים הצמחים לא הראו הבדל בהשוואה לצמח, WT פרט לפנוטיפ עלי הכותרת בפרח GOB נראה כי הביטוי של.pGOB>>GOB m מקטע בעזרת הפרומוטר ששובט מחמיר את פנוטיפ הצמח בשלבים המוקדמים ואינו משפיע על שלבי ההתפתחות המאוחרים.

87 3. הקונטקסט הגנטי בו פועל.GOB,GOB LOF האללים gob1-3 ו- Gob-4d והצמחים הטרנסגנים מייצגים ו- GOF של הגן בהתאמה. פגיעה בפעולת הגן מביאה לירידה במורכבות העלה ועליה או הרחבה בביטוי גורמת לשינויים במורכבות העלה וצורתו. ישנם מספר מוטנטים קלאסיים, שבהם קיימים פנוטיפים המראים דמיון לשינויים הפנוטיפים המתקבלים כאשר משתנה רמת הביטוי של.GOB בפרק זה בחנתי את האינטראקציות הגנטיות בין GOB דומה על התפתחות העלה המורכב. לבין גורמים גנטיים נוספים המשפיעים באופן 3.1. במוטנט e מתפתחים עלים פשוטים המראים דמיון לעלים במוטנט gob,(dengler 1984) המוטנט e הוא מוטנט רצסיבי קלאסי הידוע בספרות שנים רבות שבו מתפתחים עלים פשוטים בעלי טרף גדול, רחב ובעל אונות (תמונה 23B). בעלים מאוחרים ניתן לראות התרחבות של טרף חסר פטוטרת המתפתח מתחת לעלעל הראשי על העורק המרכזי. המוטנט מראה שכיחות גבוהה של פירות פרתנוקרפיים, בעיקר בתנאי שדה, אז מתפתחים פירות גדולים, חלולים וחסרי זרעים. אוכלוסיית המוטנטים, שיוצרה במעבדתו של פרופסור דני זמיר, הכילה חמש משפחות מוטנטים בעלי פנוטיפ דומה לזה של e. במבחני אלליות שנערכו בין חמש המשפחות נמצא כי המשפחות מתחלקות לשתי קבוצות קומפלמנטציה ומייצגות פגיעה בשני גנים שונים. המשפחות n0741(e-2) e0888(e-3), e3335(e-4), שייכות לקבוצת קומפלמנטציה אחת, e2978, e2986.e המכילה אללים של המוטציה e, ועל כן סומנה המשפחות שייכות לקבוצת קומפלמנטציה שניה שסומנה כ- leaf-like Wang et al. 2005.potato דיווח על קשר אפשרי בין IAA9,e הגן IAA9 לפנוטיפ העלה הפשוט הנראה במוטנט והביא אותנו לבחון את רצף הגן e-4 באללים של e, שנמצאו באוכלוסיית המוטנטים. באלל נמצאה מוטציית החלפת בסיס היוצרת קודון פסק, 3-e ובאלל נמצאה מוטציה בגבול בין אינטרון לאקסון, הגורמת לשינוי בתוצרי השחבור (תמונה 22). בבחינה של הרצף הגנומי של האלל n0741 לא נמצא שינוי ברצף. בהכלאות ששימשו לבחינת אינטראקציות גנטיות השתמשתי באלל 2-e.

88 תמונה 22. המוטנט e מייצג פגיעה בגן. IAA9 ריבוע לבן מסמן אקסון, הקו השחור מסמן אינטרון והפס האפור מסמן את המוטיבים השונים בגן. מיקום המוטציה ואופייה מסומן בחץ. 3.1.1 ירידה בביטוי GOB מחמירה את פנוטיפ העלה הפשוט של המוטנט e הדמיון בפנוטיפ העלה הפשוט של המוטנטים gob ו -e מרמז כי הגנים GOB ו -E פעילים בתהליך קביעת צורת העלה באותו כיוון של האצת התמיינות העלה. במטרה לברר מהם היחסים הגנטיים בין גנים אלה נבחנו שתי אינטראקציות גנטיות: בין המוטנטים gob ו- e, ובין pfil>>mir164 ישנה פגיעה במריסטמה, אשר יכולה להשפיע באופן משני על תהליכי יצירת ו- e. במוטנט gob העלים (תמונה 8). בצמח GOB ישנה ירידה בביטוי pfil>>mir164 בעלים בלבד, כך שמתקבל e pfil>>mir164 צימוח נורמאלי ועלים פשוטים יותר 11). (תמונה הכלאה בין והמוטנט נערכה במטרה לבחון האם האינטראקציה בין GOB ל- E מתקיימת בעלים בנפרד מתפקיד GOB במריסטמה הקודקודית של הנצר. e/+, gob/ כללה ארבע אוכלוסיית, F2 אשר התקבלה מהכלאה עצמית של ההטרוזיגוט הכפול קבוצות פנוטיפיות ברורות:, WT המוטנט, e המוטנט gob ומוטנט כפול. gob/+ e/e צמח בקבוצת הנבטים, אשר מראים איחוי של הפסיגים גם נכלל זו המוטנט ההומוזיגוט הכפול, gob/gob e/e ובעוד שהמוטציה gob מתנהגת באופן רצסיבי ברקע,WT בצמח gob/+ e/e ניתן.( 23A-C המוטנטים הכפולים gob/+ e/e ו - היה לראות החמרה של פנוטיפ e (תמונה e הינם דומים ומראים החמרה של פנוטיפ מבחינת צורת העלה וצורת pfil>>mir164 e/e הצימוח (תמונה,23A). 23D-F החמרת הפנוטיפ נמשכת בשלב הרפרודוקטיבי, שבו עלי הגביע

89.(23G-H, 23K-L הפירות במוטנטים הכפולים הם פרתנוקרפיים ומאורכים יותר בהשוואה לפרי e/e (תמונה ). 23I-J תמונה 23. ירידה בביטוי GOB מחמירה את פנוטיפ A. e ש. מאל-צמח e בוגר וימין- צמח e/e gob/+. B. עלים מספר 1,3,5 של. C. e/e עלים מספר 1,3,5 של gob/+. D. e/e x עלים מספר 1,3,5 של. E. pfil>>mir164 עלים מספר 1,3,5 של. F pfil>>mir164. e/e צמח. pfil>>mir164 e/e תפרחת. H. תפרחת pfil>>mir164. G. בוגר pfil>>mir164 e/e. I פרי. J. pfil>>mir164 פרי. pfil>>mir164 e/e הפרי נעשה צר לכיוון החלק התחתון.. pfil>>mir164 e/e עלי גביע. L. עלי גביע pfil>>mir164. K ההחמרה הנראית בשילוב המוטנטים בהשוואה לפנוטיפ המוטנטים הבודדים, מרמזת על כך ש- E ו- GOB משפיעים על התפתחות ומבנה העלה באותה צורה אך דרך שני מסלולים שונים או חופפים חלקית.

90. 3.1.2 Gob-4d ו- e משפיעים על צורת העלה דרך מסלולים שונים הפנוטיפ של צמח gob/+ e/e מרמז כי הגנים E ו GOB- פעילים בכיוון דומה E בהתפתחות העלה. מטרת ההכלאה Gob-4d/Gob-4d x e/e היתה לבחון האם mir164 GOB הגדרת גבול, המעודד יצירת צורת עלעל באמצעות בקרה על mir164 GOB פועל במעלה הזרם לאקטיבציה של E (תרשים זרימה משמאל). במקרה זה אנו מצפים כי ביטול הבקרה על ביטוי GOB על ידי, mir164 כפי שקורה במוטנט Gob-4d יתקן את פנוטיפ e ויהיה אפיסטטי לו. מודל כזה יכול להתאים למדווח בספרות, מאקטב את, mir164 ולכך ש- E עשוי לפעול כמעכב תגובה לאוקסין. על פיו אוקסין פנוטיפ העלים בצמח Gob-4d/+ e/e דומה לפנוטיפ העלים במוטנטים הבודדים עלייה וישנה.( 24A-B הדרגתית בהתבטאות של פנוטיפ Gob-4d/+ (תמונה בעלים המאוחרים יש התעוותות e והתקפלות של מבנה העלה והעורק המרכזי נעשה רחב ושטוח יותר. צורת הצימוח דומה לצימוח של ויש יצירה של פירות פרתנוקרפיים (תמונה 24C). העלים הראשונים במוטנט ההומוזיגוט הכפול מראים מאפיינים של שתי המוטציות-הפשטות של e בתוספת כיווץ באזור Gob-4d/Gob-4d e/e העורק המרכזי בנקודה שבה מתפתח הטרף (תמונה.(24D-E התפצלות המריסטמה בשלב מוקדם במוטנט ההומוזיגוט הכפול גורמת לצימוח שיחי ודחוס והצמח אינו מגיע לשלב רפרודוקטיבי. תמונה.24 פנוטיפ הצמחים בהכלאה. A. Gob-4d x e צמח Gob-4d/+ e/e צעיר. B. עלים של צמח. C. Gob-4d/+ e/e צמח Gob-4d/+ e/e בוגר. D. צמח Gob-4d/ Gob-4d e/e צעיר. E. עלים של צמח. F. Gob-4d/ Gob-4d e/e צמח Gob-4d/ Gob-4d e/e בוגר.

91 תוצאות אלה מצביעות על אפיסטטיות של e על Gob-4d בשלבים המוקדמים של התפתחות העלה, e ותהליך הדרגתי של התגברות השפעת Gob-4d על בעלים המאוחרים. התוצאות מראות כי שני הגנים פעילים במסלולים שונים לפחות באופן חלקי, וכי הקשר הגנטי ביניהם משתנה במהלך התפתחות הצמח. 4d 3.2. במוטנט (lyr) lyrate מתפתחים עלים המראים דמיון לצמח pfil>>gob המוטנט lyr הוא מוטנט קלאסי המראה עלים פחות מנוצים בעלי עלעלים עגולים, המראה דמיון לצמח,pFIL>>GOB 4d אשר מבטא ביתר את GOB בפרימורדיה. באוכלוסיית המוטנטים נמצא.(25A-B lyr2 אלל (lyr1) n2331 בנוסף לאלל שמקורו ב- TGRC-Davis (תמונה המריסטמה הקודקודית של הנצר היא פתוחה יותר כיוון שמרווח הזמן שבין התארכות העלה הראשון לגדילת.(25F עלה השני הוא ארוך יחסית, ואז אין הטיה של העלה הראשון מעל למריסטמה (תמונה הצמח שומר על שלטון קודקודי והוא בד"כ קטן בהשוואה לצמח נורמאלי (תמונה 25C). בפרח מתפתחים פרחים אקטופים על עלי הגביע ובשולי מריסטמת הפרח מתפתחים פרחים נוספים, ובפרח נראות תוספות אקטופיות בשולי עלי הכותרת. עלי הכותרת מתפצלים בחלק העליון למספר אונות וצינור האבקנים אינו מאוחה (תמונה.(25D-E, 25G בפרח הראשוני המתפתח יש עמוד עלי רחב ושחלה פחוסה, בפרחים האקטופים המאוחרים עמוד העלי הוא קצר ואין הפרדה מורפולוגית בין השחלה לעמוד העלי מבחינת רוחב האיבר 25H). (תמונה הפרי הוא בעל צורה דמוית אגס, ובד"כ פרתנוקרפי. לעיתים מתקבל פרי המורכב מאיחוי של מספר פירות, כתוצאה מריבוי הפרחים, ואז בתחתית הפרי נראה פתח שמקורו בחוסר איחוי מלא של עלי השחלה (תמונה.(25I-M עלי הגביע הם מאוחים חלקית ויוצרים מעין משטח, אשר בפרי בודד יוצרים מעין כיפה ובפרי מרובה שחלות התעבות של משטח עלי הגביע (תמונה,25J). 25K

92 תמונה.25 פנוטיפ המוטנט. A,C-M. lyrate אלל. B. lyr1 אלל. A lyr2 עלים מספר 1,3,5 באלל. B. lyr1 עלים מספר 1,3,5 באלל. C. lyr2 צמח צעיר. D. פרח לאחר התפתחות הפרחים האקטופים. SEM. E של פרח. F. מריסטמה קודקודית. G. פרח שנחתך לאורכו. H. שחלה ועמוד העלי בפרח אקטופי מאוחר.. I פרי שהתפתח מאיחוי של מספר שחלות.. J הפרי מצידו העליון. עלי הגביע יוצרים מעין משטח עבה אשר התקפל בגלל ריבוי הפירות שגדלו. K. פרי יחיד.. L פרי דמוי צורת אגס. M. פרי אקטופי שהתפתח על גבי עלי הגביע.. 3.2.1 המוטנט lyr1 מחמיר את הפנוטיפ הנראה במוטנטים Gob-4d המוטנט lyr1 דומה פנוטיפית לצמח טרנסגני המבטא ביתר את. GOB במטרה לאפיין את היחסים הגנטיים בין gob ו- lyr1, יוצרו מוטנטים כפולים בין lyr1 ל Gob-4d-. ההנחה היא שהמוטנט הכפול יראה החמרה של פנוטיפ, Gob-4d אם lyr1 נובע מעלייה בביטוי, GOB וזאת כיוון שתהיה עליה נוספת בביטוי GOB בצמח. המוטנט הכפול מראה ירידה במורכבות העלים ביחס למוטנטים הבודדים (תמונה 26A-C בהשוואה לתמונה ). 25A בעלה מאוחר העלעלים מקופלים ובעלי אונות.(26D-F עמוקות וישנה רקמה בעלת אופי מריסטמטי על גבי הפטוטרת (תמונה במוטנט

93 שבהם האבקנים קצרים ואינם מאוחים, עלי,Gob-4d הכותרת מראים תוספת רקמה בשוליהם, והשחלה קצרה ומעובה כמו ב- lyr1 (תמונה ). 26G-H תמונה 26. שילוב המוטציות lyr1 ו- Gob-4d מחמיר את הפנוטיפ הנראה במוטנטים. הבודדים Gob-4d/Gob-4d פסיגים ועלים ראשונים של. B. Gob-4d/Gob-4d עלים ראשונים של. A. E. Gob-4d/Gob-4d עלים מאוחרים של. D. Gob-4d/Gob-4d צמח lyr1/lyr1. C. lyr1/lyr1 עלים מאוחרים של F.. Gob-4d/Gob-4d lyr1/lyr1 תקריב על פטוטרת בעלה Gob-4d/Gob-4d. Gob-4d/+ פרחים של lyr1/lyr1. G ניתן לראות קיפולים בעלי אופי מריסטמטי.. lyr1/lyr1. Gob-4d/Gob-4d פרחים של lyr1/lyr1. H פנוטיפ המוטנט הכפול מעיד כי הגנים פועלים באופן אנטגוניסטי על הגדילה וההתרחבות של העלה ובשלב הרפרודוקטיבי של הצמח, אפשר שהם פעילים דרך מסלול משותף.. 3.2.2 הירידה בביטוי GOB מחלישה חלק מהפנוטיפים של המוטנט lyr אחד ההסברים לדמיון בין פנוטיפ lyr1 ל Gob-4d- הוא כי LYR1 מעכב את GOB כך שבמוטנט. lyr1 כדי לבחון אפשרות זו יוצר מוטנט כפול pfil>>mir164. GOB תהיה עלייה בביטוי lyr1 אם חלק מפנוטיפ lyr1 אכן נגרם מעלייה בפעולת GOB,.אז הורדת ביטוי GOB תוביל להחלשת המאפיינים בפנוטיפ. lyr1 בעלים של pfil>>mir164 העלעלים מפוזרים לאורך העורק המרכזי,

94 ישנו אזור שטוח בקצה הפטוטרת שממנו יוצאים מספר עלעלים, בנוסף lyr1/lyr1 pfil>>mir164 לעלעלים שמסודרים לאורך העורק המרכזי.(27A-B (תמונה העלים של lyr1/lyr1 הם בעלי פטוטרת ארוכה ורוב העלעלים יוצאים מאזור שטוח בחלק העליון של הפטוטרת (תמונה 27C). בעלים המאוחרים יש התרחבות מסוימת של העלעלים וסידור העלעלים נעשה אחיד לאורך העורק המרכזי. pfil>>mir164 lyr1/lyr1 צמח מראה צורת צימוח של (תמונה.( 26G lyr1/lyr1 צורת הצימוח של המוטנט הכפול מראה החלשה של אופי pfil>>mir164 הצימוח הדחוס של (תמונה.(26D-F בשלב הרפרודוקטיבי מתקבלת החלשה של פנוטיפ. lyr1/lyr1 עלי הגביע מראים איחוי חלקי וחלש ביחס לעלי הגביע המאוחים של, lyr1/lyr1 הפרח מסודר ואין אבקנים ושחלות אקטופים (תמונה,27Q 27G-L במרכז). לעיתים יש איחוי בין עלי הגביע ועלי הכותרת ואז יש שארית רקמה של עלי הכותרת גם לאחר יצירת הפרי (תמונה 27K). הפרי של המוטנט הכפול הוא בעל צורה דמוית אגס בדומה לפרי ) lyr1/lyr1 תמונה ). 27M-O תמונה 27. הירידה בביטוי GOB מחלישה את פנוטיפ A.. lyr11 עלים מספר 1,3,5 של. B. pfil>>mir164 עלים מספר 1,3,5 של. C. lyr11/lyr11 עלים של המוטנט הכפול